Plazmid DNA teslimat için fare mesane Urothelium elektroporasyon tarafından roman yöntemi
Summary
Biz’DNA plazmid dır fare mesane vivo içinde İdrar Kateterizasyon ve elektroporasyon ürotelyal hücre içine bir roman yöntemi açıklanmaktadır. Kesesi hastalıkları otokton fare modelleri oluşturmak için hızlı ve kolay bir yol sunar.
Abstract
Genetiği fare modelleri (GEMMs) insan hastalıkları kanser gibi başlama ve ilerleme mekanizmalarının içine roman biyolojik anlayışlar ortaya son derece değerlidir. Transgenik ve koşullu nakavt fareler sık gen overexpression için kullanılmış olan veya ablasyon belirli doku veya hücre içinde vivotürleri. Ancak, germline fare modelleri oluşturma zaman alıcı ve pahalı olabilir. Gen teknolojileri ve DNA plazmid tarafından viral enfeksiyon teslim fizibilite düzenleme son gelişmeler hızlı oluşturulmasında çeşitli organları germline sigara otokton fare kanser modelleri etkinleştirdiniz. Mesane urothelium kapsayan bir glikozaminoglikan katman varlığı nedeniyle erişmeye viral vektörler için zor olan bir organdır. Burada, laboratuar DNA plazmid verimli bir şekilde teslim içine fare mesane urothelium içinde vivoiçin geliştirilen bir roman yöntemi açıklanmaktadır. PCAG-GFP DNA plazmid İntravezikal korumak ve cerrahi olarak maruz mesane çoğalmasıyla, DNA plazmid geçici ifade için mesane ürotelyal hücre içine özellikle teslim olduğunu göster. Bizim yöntem overexpression ve fare mesane genlerin nakavt için hızlı ve uygun bir yol sağlar ve GEMMs mesane kanseri ve diğer üroloji hastalıkları bina için uygulanabilir.
Introduction
Genetiği fare modelleri (GEMMs) hayvan geliştirme, gen fonksiyonları vivo içindeve mekanizmaları hastalık ilerleme1,2hakkında bilgimizi genişletmek önemli bir rol oynuyor. Germline GEMMs geleneksel olarak iki şekilde geliştirilmiştir. İlk DNA plazmid pseudopregnant kadın zigotları nakli tarafından takip pronuclear enjeksiyonla transgenik fareler oluşturulmasıdır. Diğer knock-out/knock-gelen fareler tarafından homolog rekombinasyon embriyonik kök hücre üretimi ve chimeras gelişimi bu. Genlerin ilgi belirli doku veya hücre türü koşullu nakavt Cre ve flox siteleri ile genetik allelleri üreme birden çok nesiller için içerir. Kül oluşum-ebilmek var olmak pahalı ve zaman alıcı, özellikle hedef doku-özellikle birden çok gen hedef için ise. Son zamanlarda, gen düzenleme teknolojileri kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) gibi çeşitli organlarda doku özgü genetik değişiklikler otokton kanseri3modelleme için ikna etmek için farelerin uygulanmış olan, 4,5,6,7 veya doğru hastalık mutasyonlar in situ8,9. Bu çalışmalarda gRNA vektörler teslimini genellikle adenoviral veya lentiviral enfeksiyonu organ veya hidrodinamik kuyruk-damar enjeksiyon elde edildi. Akciğer ve karaciğer için CRISPR bileşenlerinin teslimatlar göreli kolaylığı büyük ölçüde kolaylık ve geleneksel Cre-Lox göre fare modellerle karşılaştırıldığında bu organlarda modelleme kanser verimliliği iyileşmiştir.
Mesane urothelium nereden köken çoğu mesane tümörleri var. Mesane urothelium kanser modelleme veya gen tedavisi için DNA vektörel çizimler teslimini glikozaminoglikan katmanı apikal ürotelyal yüzeyinde, bulaşıcı virüs10,11bağlılık için bir engel olarak engel oluyor. Syn3 ve lauryl-β-d-maltoside gibi birkaç tedavi öncesi Aracısı bu bariyer bozabilir ve adenovirus enfeksiyonu verimliliği12,13,14geliştirmek için kullanılmaktadır. Olup olmadığını virüs (AAVs) Adeno ilişkili etkin bir şekilde-ebilmek bulaştırmak mesane bildirilmemiştir. Genel olarak, bir viral tabanlı teslimat yöntemi arzu olurdu. Burada, verimli DNA plazmid teslim edilmek üzere fare urothelium İdrar Kateterizasyon ve elektroporasyon Laboratuarında geliştirilmiş bir roman yöntemi açıklanmaktadır. Yaklaşımımız kimyasal Önarıtma glikozaminoglikan katman veya virüs üretim anlamına gelmez çünkü o önemli ölçüde DNA plazmid teslim fare mesane urothelium içine kolaylaştırır ve çeşitli in vivo çalışmalar kolaylaştırmak gerektiğini Mesane hastalıkları.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elektroporasyon hücre membran geçirgenliği artırır ve gen electrotransfer16için güçlü bir teknolojidir. Gen teslim yaşam kemirgenler tarafından elektroporasyon içine Nörobiyoloji alanları17,18,19,20,21‘ sık kullanılan. Onun potansiyel uygulamalar birçok diğer organlarda kapsamlı bir şekilde araştırılmalıdır değ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Profesör Bin Chen, Dr Yue Zhang ve Kendy Hoang elektroporasyon sistemi kurma konusunda yardım için teşekkür ederim. Bu iş Z.A.W. için Santa Cruz kanser fayda grubu ve NIH gelen hibe tarafından desteklenmiştir
Materials
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
- Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
- Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
- Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
- Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
- Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
- Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
- Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).
