蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性
Summary
二本鎖 DNA 切断の修復は、病変を対処した後、休憩だけでなく、その解像度で修復複合体の形成だけではなくを必要とする動的なプロセスです。ここは、蛍光顕微鏡過渡的かつ長期的な二本鎖切断ツールとしてこのゲノム維持機構を解剖します。
Abstract
DNA の二本鎖切断 (Dsb) の修理は非常に調整されたプロセス、形成し複数タンパク質の修復複合体の解像度が必要です。このプロセスは、関連付けを促進するタンパク質の無数およびこれらの病変に蛋白質の脱退によって規制されています。蛋白質の広大な図書館の機能画面を実行する能力に大部分のおかげで、二本鎖 DNA 切断の修復に必要な遺伝子のより深い理解があります。よくノックアウトまたは化学的阻害剤スクリーンは、DSB の修復に必要な蛋白質のマーカーとして高められた毒性を使用して修理プロセスに関与する蛋白質を識別します。識別する新規細胞タンパク質ゲノムの忠実性を維持に関与するに役立つ、機能解析が必要です興味の蛋白質は、ローカリゼーション、形成、または修復複合体の解像度を促進するかどうかの決定。
蛍光顕微鏡による、明瞭な核の巣として修理蛋白質の蓄積を容易に検出できます。したがって、DNA 損傷のサイトでこれらの蛋白質の加盟および脱退は、二本鎖 DNA 切断の誘導後代表的な間隔でこれらの核の巣を観察することによってアクセスできます。このアプローチは、修理欠陥が修理不完全な遅れに同時に発生しない場合も誤ローカライズされた修復因子蛋白質を識別できます。このシナリオでは、長期的な二重鎖 DNA 切断は細胞と酵素の認識部位が細胞のゲノムに統合されました珍しい切削エンドヌクレアーゼ (例えば、SceI) を表現することによって設計することができます。結果として得られる病変は特に忠実な修復酵素の認識部位、胸の谷間の別のラウンドをプロンプトを再導入すると解決するは難しい。その結果、修復の動態の違いが解消されます。修理錯体が形成されていない場合、ローカリゼーションは妨害されました。このプロトコルでは、修復反応として修復タンパク質の局在の変化を識別するために必要な方法について説明します。
Introduction
毎日、人間の体のあらゆる細胞は推定 10,000 殺到 DNA 病変1。この実存的な脅威は、セルと同様、突然変異、発癌のリスクが私たちを置く死。ゲノムの忠実性を保護するために哺乳類細胞は一連の複雑な蛋白質の関連付けと修正と DNA 損傷に対応するため進化してきた。この応答は、まとめて DNA 損傷応答 (DDR)2,3と呼ばれる、複数の経路に編成されます。DDR は、DNA 損傷、時間的、空間的調整で DNA 修理蛋白質の蓄積で構成されています。DDR はよく伝搬または破損した DNA2,4、5のレプリケーション中に発生する被害の激化を避けるために細胞周期の停止を誘導します。ターンも、修理が完了した後修理錯体の関連付けを解除によって細胞周期の停止をオフに細胞の生存のため必要です。
DNA 損傷の様々 な種類、Dsb は最も有害があります。Dsb の修復に失敗したは、染色体組換え誘発または全体の染色体腕の損失など大規模な削除につながります。Dsb の修復は 2 経路6,7、8に分かれています。相同組換え (HR) は、姉妹を必要と染色体 DNA のテンプレートとして使用する、従って細胞周期9,10S と G2/M 後期に限られます。非相同末端結合 (NHEJ) は、これらの制限はありませんが、Dsb11,12を修復するときに小さな削除を引き起こすことができます。
DSB 修復具体的、DDR 一般に調査のアクティブな領域。便利な区切られた経路にまとめられ、にもかかわらず多大な冗長性があります。確かに、複数経路13,14,15,16(BRCA1、BRCA2、および例の複雑な RPA) 多くのタンパク質が関与しています。1 つの経路による病変の修復は、別経路14で修復する必要があります中間の損傷につながることができます。必要な時間の正確な量を適切な場所に右の蛋白質を採用、複雑なタスクと組み合わせて、これらの経路の多階層を規制する必要があります。
最近の報告書は、修理複雑な形成、解像度、およびローカリゼーションの各別々 にできる障害17示すことによって DDR の複雑さを強調表示します。次のプロトコルの全体的な目標は、決定的に DSB を修復する細胞の能力を分析することです。蛍光顕微鏡を用いた、Dsb の誘導代表時点で損傷部位で修理蛋白質の蓄積を視覚化できます。
この技術は、一般的に使用される方法をいくつかの利点を持っています。多くの場合、修理は単一の時間ポイントで調査およびアセンブリの動的過程と修理錯体の解離を表すことができません。フル解像度の最初のライセンス認証から修理の完全な範囲を観察することにより、修理の遅れは完全に抑制として誤認されたないこと。逆に、それは当該対策を不活性化することができる修復反応の誘導は通常または過度の活性化として誤認しないことを保証します。
遅延タンパク質複合体形成と修復タンパク質の誤ローカリゼーションただし、可能性があります明確に区別しないでこの方法で。修復タンパク質がミスとローカライズされた局在の遅延か確かめるには、細胞の DNA の酵素の開裂を「長期的な」DSB を導入できます。結果病変はそれが修復された明瞭な大型核修理フォーカスの結果、募集から時間制限を解除するたびに改修されました。これは、長期的な DSB を誘導するまれな切削エンドヌクレアーゼ (例えば、SceI) の使用に既存のアプローチを変更することによって実現できます。Dsb の寿命は、蛍光顕微鏡でとらえどころのない修復タンパク質の可視化を実現。 にします。抗体の品質、低い研究蛋白質が DNA の修復に影響を与えることがわかったときに役に立つかもしれない機能の制限による検出を妨げてと強化された豊かさが可視化を向上することはまた。
特に、我々 は無料の画像処理と解析ソフトウェア (例えばImageJ) について明示的な指示を提供します。これはより多くのオーディエンスに DNA 損傷修復の尋問を開く、画像解析の主要な金融の障壁を削除します。
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA の分析損傷修理一般、二本鎖 DNA 切断の修復具体的には研究の活発な領域その結果基礎生物学6,20に腫瘍にまたがるため。この原稿の詳細14Dsb の修復タンパク質機能を解明するため正確に時間を楽しみ、このメソッドを介して Dsb の解像度に RAD51 と γ H2AX 蛋白質の貢献を暴き出すアプローチを使用できます。修復動態比較とノッ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ジョエル Sanneman とによって、カンザス州立大学獣医学の大学、この手法を開発する努力の彼らのサポートのための資金を提供、共焦点顕微鏡コアの博士 Philine の Wangemann に感謝しますpCBASceI だったマリア Jasin (Addgene プラスミド # 26477) からの贈り物 30。U2OS DR GFP の細胞だったマリア Jasin18からの優しい贈り物です。
Materials
| 12mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
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