Характеризуя процессов репарации ДНК в переходных и Long-lasting двухнитевые разрывы ДНК по микроскопии иммунофлуоресценции
Summary
Ремонт двухнитевые разрывы ДНК представляет собой динамичный процесс, требующий не только образование комплексов ремонта на перерывы, но и их резолюции после поражения решается. Здесь мы используем иммунофлуоресценции для переходных и long-lasting двуцепочечные разрывы как инструмент для вскрыть этот механизм обслуживания генома.
Abstract
Ремонт двуцепочечные разрывы (DSBs) в ДНК является весьма скоординированного процесса, что обусловливает необходимость формирования и разрешению многих белков ремонт комплексов. Этот процесс регулируется мириад белков, которые способствуют ассоциации и дизассоциация белков для этих поражений. Благодаря в значительной степени способности выполнять функциональные экраны обширной библиотеки белков, есть большую признательность генов, необходимых для ремонта перерыв двухручьевой ДНК. Экраны часто нокаут или химического ингибитор идентификации белков, участвующих в процессах восстановления, используя увеличение токсичности в качестве маркера для белка, который необходим для ремонта DSB. Хотя полезно для выявления роман клеточных белков, участвующих в сохранении верности генома, функциональный анализ требует определения ли протеина интереса способствует локализации, формирование или разрешение ремонта комплексов.
Накопление белков, ремонт может быть легко обнаружен как собственный ядерный очагов иммунофлуоресценции. Таким образом ассоциации и дизассоциация этих белков в местах повреждения ДНК могут быть достиганы наблюдая эти ядерные очагов представитель интервалами после индукции двухнитевые разрывы ДНК. Этот подход также может определить неправильно локализованных ремонт фактор белков, если ремонт дефектов происходит одновременно с неполной задержек в ремонт. В этом случае долговечные двухнитевые разрывы ДНК могут быть спроектированы выразить редких резки эндонуклеазы (например, SceI) в клетках, где признание сайт для указанного фермента был интегрирован в клеточного генома. Результате поражения особенно трудно решить как верный ремонт будет вновь фермента признание сайта, вызвав еще один раунд расщепления. В результате устранены различия в кинетике ремонта. Если ремонт комплексы не образуются, препятствуют локализации. Этот протокол описывает методологии, необходимые для идентификации изменений в кинетика ремонт, а также ремонт белка локализации.
Introduction
Каждый день, каждая клетка в организме человека обстреляли с примерно 10 000 ДНК поражений1. Эта экзистенциальная угроза ставит нас на риск мутации, онкогенеза, а также клеток смерть. Для защиты генома верности, клетки млекопитающих эволюционировали, чтобы ответ на повреждения ДНК с серию сложных белков ассоциаций и модификаций. Этот ответ разделено на несколько путей, известные как ДНК повреждения ответ (ГДР)2,3. DDR состоит из накопления протеинов ремонта ДНК в повреждения ДНК, координировала височно и пространственно. DDR часто побуждает арест клеточного цикла, чтобы избежать распространения или интенсификация повреждения, которые могут произойти во время репликации поврежденной ДНК2,,4–5. В свою очередь это также необходимо для клеточной жизнеспособности выключить арест клеточного цикла, отмежевывается ремонта комплексы, после завершения ремонта.
Среди различных видов повреждения ДНК DSBs являются наиболее пагубным. Неспособность восстановить DSBs может привести к хромосоме перестановки или крупномасштабных изъятия такие потери всей хромосомы оружия. Ремонт DSBs делится на два пути6,,7–8. Гомологичная рекомбинация (HR) требует сестра хромосома для использования в качестве шаблона ДНК и таким образом ограничивается конце S и G2/M фазы клеточного цикла9,10. Non гомологичных конец присоединения (NHEJ) не имеют эти ограничения, но может привести к небольшой удаления при ремонте DSBs11,12.
DSB ремонт специально и РДР в целом являются активные области расследования. Несмотря на организуются в удобно разлученных пути, есть много избыточности. Действительно многие белки (BRCA1, BRCA2 и комплекс для примера РПА) участвуют в нескольких путей13,14,,1516. Ремонт поражения на один путь, может привести к повреждению промежуточных, которые должны быть отремонтированы на другой путь14. Переплетение этих путей, в сочетании с их сложной задачей подбора право белков в нужное место для точное количество времени, необходимое, требует многоуровневого процесса регулирования.
Недавнем докладе подчеркивается в тонкостях DDR, продемонстрировав, что ремонт комплекс формирования, резолюции, локализации каждый отдельно можно и нарушением17. Общая цель следующий протокол является окончательно вскрыть способность клеток для восстановления DSB. С помощью иммунофлуоресценции, накопление протеинов ремонта на объектах повреждения могут быть визуализированы на представителя время точках после индукции DSBs.
Этот метод имеет несколько преимуществ для часто используемых подходов. Часто ремонт исследованы в одно время точках и неспособно представляющие динамичный процесс сборки и диссоциации ремонт комплексов. Наблюдения за полный спектр ремонта от первоначальной активации полной резолюции гарантирует, что задержка в ремонт не ошибочно как полное торможение. Наоборот он уверяет, что индукции ремонт ответ, что не способна инактивировать сказал ответ не ошибочно как нормальный или чрезмерного активации.
Комплекс формирования отсроченного белка и неправильного локализации ремонт белков, однако, могут не отличать однозначно с этим подходом. Чтобы определить, если ремонт белки являются неправильно локализованных против задержки в их локализации, «long-lasting» ОУС могут быть введены путем ферментативного расщепления клеточной ДНК. Результате поражения срезайте каждый раз, когда он отремонтирован, приводит в фокусе различных крупных ядерных ремонт и удаление временных ограничений из набора. Это может достигаться путем изменения существующего подхода с использованием редких резки эндонуклеазы (например, SceI) вызвать длительный DSB. Долговечность DSBs позволяет визуализацию неуловимого ремонт белков, иммунофлуоресценции. Расширенной изобилие также могли бы улучшить визуализации, когда обнаружение препятствуют ограничения в качестве антитела, функция, которая может быть полезной, когда менее изученных белки определены как имеющие влияние на репарации ДНК.
В частности мы предоставляем четкие инструкции для бесплатный изображений обработки и анализа программного обеспечения (например, ImageJ). Это снимает крупным финансовым барьером в анализ изображений, открыв допроса ДНК повреждения ремонт для более широкой аудитории.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ ДНК повреждения ремонт в целом и ремонт двуцепочечные разрывы ДНК специально активной областью исследований, потому что его последствия охватывают tumorigenesis фундаментальной биологии6,20. Эта рукопись детали, подход, который точно анализирует вклад R…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Joel Sanneman и доктор Philine Вангеманн конфокальная микроскопия ядра, финансируемых на Канзас государственный университет колледж ветеринарной медицины, за их поддержку усилий по разработке этой техники. pCBASceI был подарок от Мария Jasin (Addgene плазмиды # 26477) 30. Клетки U2OS DR-ГФП были рода подарок от Мария Jasin18.
Materials
| 12mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
- Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
- Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D’Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).
- Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
- Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
- D’Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
- Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
- Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
- Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
- Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
- Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957 (2010).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
- Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237 (2015).
- Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases–from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).
