Calorespirometry: Een krachtige, Noninvasive benadering onderzoeken van cellulaire energiemetabolisme

Summary

Dit protocol beschrijft calorespirometry, de directe en gelijktijdige meting van zowel warmteafvoer en ademhaling, waarmee een noninvasive aanpak om te beoordelen van de energie-stofwisseling. Deze techniek wordt gebruikt ter beoordeling van de bijdrage van zowel aerobe en anaerobe emissieroutes naar energie gebruik door toezicht op de totale cellulaire energiestroom.

Abstract

Veel gebruikt in de biologische en biomedische basisonderzoek cellijnen handhaven energie homeostase door een combinatie van zowel aërobe en anaërobe ademhaling. De mate waarin beide trajecten tot het landschap van cellulaire energieproductie bijdragen is echter consequent over het hoofd gezien. Getransformeerde cellen gekweekt in het verzadigen van de niveaus van de glucose vaak Toon een verminderde afhankelijkheid op oxidatieve fosforylatie voor ATP productie, die wordt gecompenseerd door een toename van de substraat-niveau fosforylering. Deze verschuiving in metabole poise kunt cellen te verspreiden ondanks de aanwezigheid van mitochondriale toxines. De gewijzigde metabole poise getransformeerde cellen negeren, resultaten van een farmaceutische screening kunnen worden geïnterpreteerd sinds de potentieel mitotoxic effecten niet worden gedetecteerd met behulp van model cellijnen gekweekte in aanwezigheid van hoge glucose concentraties. Dit protocol beschrijft de koppeling van twee krachtige technieken, respirometrie en calorimetrie, waarmee voor de beoordeling van het kwantitatieve en noninvasive van zowel aerobe en anaerobe bijdragen aan cellulaire productie van ATP. Zowel aërobe en anaërobe ademhalingen genereren van warmte, die gecontroleerd via calorimetrie worden kan. Ondertussen, het meten van de snelheid van zuurstofverbruik kan beoordelen in welke mate van aërobe ademhaling. Wanneer zowel warmteafvoer en zuurstofverbruik gelijktijdig gemeten worden, kan de verhouding van de calorespirometric worden bepaald. De experimenteel verkregen waarde kan vervolgens worden vergeleken met de theoretische oxycaloric gelijkwaardig en de omvang van de anaërobe ademhaling kan worden beoordeeld. Calorespirometry biedt dus een unieke methode om een breed scala aan biologische vragen, met inbegrip van de Geneesmiddelenontwikkeling, microbiële groei en fundamentele Bioenergetica onder zowel normoxic als hypoxische voorwaarden te analyseren.

Introduction

In biologische systemen, de warmte-release of enthalpie verandering tijdens de stofwisseling is doorgaans bewaakt ofwel direct (via directe calorimetrie) of indirect via O₂ verbruik en/of CO₂ productie (via respirometrie). Helaas, wanneer deze technieken worden gebruikt in isolatie, kritische informatie gaat verloren, zoals de bijdrage van anaërobe emissieroutes naar de cellulaire metabolisme. Calorespirometry is een krachtige techniek die op de gelijktijdige meting van zowel de warmteafgifte en de ademhaling berust. Calorespirometric pionierswerk de anaërobe metabolisme in volledig zuurstofrijk zoogdiercellen onderzocht en aangetoond gelijktijdige bijdragen van zowel aerobe en anaerobe emissieroutes naar energie homeostase ondanks de veranderde cellen worden een volledig zuurstofrijk milieu¹. Calorespirometry heeft inmiddels een breed scala aan biologische vragen vereffend. Enkele voorbeelden zijn de studie van dierlijke energetics op lage zuurstofniveaus, de effecten van zowel oestrogeen als herbicide op de kieuwen van tweekleppigen, het metabolisme van terrestrische organismen en de microbiële afbraak van organische bodem zaak^{2, 3 , 4 , 5 , 6}. verder calorespirometry heeft geopenbaard hoe metabole conditionering vóór bevriezing verbetert de cryopreservatie van zoogdier-⁷cellen. Elk aanpak, zowel calorimetrie en respirometrie, toegenomen zelfstandig onze kennis van cellulaire en organisch Bioenergetica. Fundamentele biologische vragen die beantwoord kunnen worden door het gebruik van calorespirometry blijven echter relatief onontgonnen.

Hess de wet bepaalt dat de totale enthalpie verandering van een reactie onafhankelijk van het pad tussen de eerste en laatste Staten is. Bijvoorbeeld, is de totale enthalpie verandering voor een biochemische weg de sommatie van de verandering van enthalpie van alle reacties binnen het traject. Calorimetrie biedt een real-time aanpak voor het meten van cellulaire warmteproductie, die lukraak zowel aërobe en anaërobe trajecten detecteert. Dit is gebaseerd op het fundament dat geen energie in het systeem, behalve door de muren van de experimentele ampul⁸wordt uitgewisseld. Een verandering in de warmteafgifte is gelijk aan de verandering in enthalpie verlost van alle metabole reacties in de ampul. Dus correleert een negatieve enthalpie met een verlies van warmte uit het systeem. Uitputtend onderzoek in de afgelopen vier decennia heeft gekenmerkt de thermodynamische landschap van zowel katabolisme en anabolisme. Deze omgeving wordt voorgesteld door een gestage stijging van de onderzoeksartikelen vinden onder de zoektermen “biologische” en “calorimetrie” als geïndexeerd door de Verenigde Staten nationale bibliotheek van geneeskunde (NLM) op de National Institutes of Health (PubMed). De zoekopdracht blijkt dat vóór 1970, een totaal van 27 publicaties referentie biologische calorimetrie; Ondertussen, in 2016 alleen, 546 publicaties gebruikt de techniek.

Colorimetrische methoden zijn gevestigde om warmteproductie. Echter wordt meer flexibiliteit verleend voor het oplossen van de respirometrische waarde. De respirometrische meting kan bestaan uit O₂CO₂, of zowel O₂ en CO₂. Verder, het meten van O₂ of CO₂ kan worden bereikt door verschillende technieken, waaronder optrodes, Clark-type elektroden en afstembare diode laser Absorptie spectroscopie^{7,9,10 ,11}. Terwijl de CO₂ productie is een waardevolle metriek in vele respirometrische studies, het medium voor gekweekte cellen vaak maakt gebruik van een bicarbonic buffersysteem voor pH control^12,13. Voorkom complicaties van CO₂ meting in het bicarbonaat-systeem, het volgende protocol voor de calorespirometry van cellen in cultuur maakt gebruik van O₂ als de enige respirometrische parameter.

Gelijktijdig met het meten van zuurstof flux, bepaalde respirometers (Zie Tabel van materialen) zijn ontworpen voor gedetailleerde evaluaties van mitochondriale functie. Substraat-uncoupler-remmer-TITRATIES (SUIT) protocollen zijn goed ingeburgerd en zijn compatibel met experimenten ontworpen voor het meten van membraan potentiële of reactieve zuurstof soorten (ROS) vorming¹⁴. Het gepresenteerde protocol voor calorespirometry van cellen intact is compatibel met de invoering van chemische uncouplers zoals carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) en de F₀F₁ATP – synthase remmer oligomycin. Door de toevoeging van FCCP, kan zuurstofverbruik worden afgekoppeld van de ATP productie, wat handig is om de impact van potentiële therapeutics op mitochondriale peformance¹⁵. Bovendien, de toevoeging van oligomycin verlicht de omvang van de ademhaling van de lek. Dus, de respirometrische metingen tijdens calorespirometry zijn compatibel met uitgebreide protocollen ter verdere verheldering mitochondriale fysiologie.

De gelijktijdige meting van zowel warmteafvoer en zuurstof flux zorgt voor de berekening van de verhouding tussen de calorespirometric (CR). Deze verhouding wordt vervolgens vergeleken met de Thornton’s constante of de theoretische oxycaloric equivalent, die tussen-430 te-480 kJ mol^-1 afhankelijk van het cellijn of weefsel van belang en de aangevuld koolstof substraten^1, varieert ¹⁶. dus, een meer negatieve CR verhouding onthult grotere bijdragen van anaërobe trajecten voor algemene metabole activiteit. Bijvoorbeeld, is de CR-verhouding voor routinematige spier weefsel ademhaling zonder de actieve uitvoering van werk varieert van-448 tot-468 kJ mol-1 die binnen het bereik valt van de theoretische oxycaloric gelijkwaardig^17,18. Ondertussen, zoogdieren kankercellen gekweekt in medium dat is hoog in glucose weer verbeterde melkzuur gisting na de glycolyse en relatief lage mitochondriale betrokkenheid¹⁹. De resultaten van dit fenotype in CR verhoudingen in het bereik van-490 naar-800 kJ mol^-1, tonen een verhoogde betrokkenheid van de anaërobe trajecten in het cellulaire metabolisme zoals aangegeven door negatiever CR verhoudingen^{1,7, 16,20}.

Zowel commerciële als non-profit cel- en weefseltransplantaties distributeurs momenteel aanbod cellijnen uit meer dan 150 soorten, met bijna 4000 cellijnen afgeleid van mensen. Vereeuwigd cellijnen zijn handige hulpmiddelen voor het snel beoordelen van de toxiciteit van potentiële therapeutics, waarvan vele direct of indirect mitochondriale functies storen. Getransformeerde cuvetten tijdens drug screening kunnen beperkte voorspellende waarde gedeeltelijk vanwege het Warburg effect, een kenmerk van veel kankers. Vaak kankers ATP genereren van substraat-niveau fosforylatie en redox evenwicht door de productie van lactaat zonder volledig het mitochondrion onder aërobe omstandigheden¹⁹. Farmaceutische ontwikkeling is notoir dure en inefficiënte, met ongeveer 8 uit 9 verbindingen getest in menselijke klinische proeven niet bereikt markt goedkeuring²¹. Terwijl potentiële therapeutics eerste screening als gevolg van lage cytotoxiciteit cellijnen doorgeeft kan, is het mogelijk dat sommige van deze verbindingen mitotoxic zijn. Zonder een geschikte methode om te ontdekken hoe deze toxines kunnen afbreuk doen aan de energiebalans in primaire cellen die het Warburg effect niet weergeven, is kritische informatie vaak overdreven keek, blokkeringen therapeutische ontwikkeling in de vroege stadia.

Calorespirometry is een praktische, noninvasive benadering voor het analyseren van de metabole activiteit in een verscheidenheid van biologische monsters, met inbegrip van cellen en weefsels. De kern van het voorgestelde protocol is compatibel met een scala aan toepassingen. Een complicatie, echter, is geconstateerd. Vereeuwigd cellen worden vaak gekweekt in een glucose-gratis medium aangevuld met galactose te vergroten van de bijdrage van oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) voor de productie van energie, om het sensibiliseren van de cellen aan potentiële mitotoxins^{22, 23}. Dit metabole herprogrammering lijkt te verdoezelen analyse wanneer monsters worden geplaatst in de stimulatiedosis van het roestvrij staal gebruikt door de calorimeter¹⁵. Cellen gekweekt in een glucose medium blijven streven naar hoge metabole activiteit gedurende enkele uren. Ondertussen, cellen gekweekt in galactose medium verlagen de warmteproductie binnen 30 min van hun plaatsing in de ampul, beperkt tot vroege experimentele tijdstippen metingen te maken. Dit gedrag is helaas belemmert de gelegenheid om te evalueren van de cellulaire proliferatie. Ondanks deze specifieke beperking, de meeste toepassingen zijn compatibel met calorespirometric analyse en metabole Detailgegegevens verkregen kan worden door deze aanpak.

Protocol

1. de celkweek Handhaven van menselijke hepatocellulaire carcinoom (HepG2) cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle’s medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en extra substraten (10 mM glucose, 2 mM glutamine en 1 mM pyruvaat) bij 37 ° C in een cel cultuur incubator (5% CO2 , 95% lucht, vochtigheid van 100%).Opmerking: Gebruik de bovenstaande DMEM formulering als DMEM in latere stappen voor respirometrie en Calorimetrie wordt verwezen. Plaat van de cellen in 1 x 106 celle…

Representative Results

De reproduceerbaarheid van de metingen van de calorespirometric is afhankelijk van een goede en consequente monstervoorbereiding. Monsters van celcultuur bereid mag niet dienen als de platen zijn begroeid, zoals cellen onjuist als gevolg van samendoen worden kunnen. Verdere, verlaagde warmte stromen als gevolg van de beperkte substraat diffusie in de geklonterd cellen kunnen optreden. Bij het gebruik van Adherente cellen, daarom kritisch te selecteren van een plaat met de confluentie tussen 60-80% en het medium 24 h vó?…

Discussion

Het doel van calorespirometry is aan de bijdragen van aërobe en anaërobe emissieroutes naar de metabole activiteit kwantitatief te evalueren en het verkrijgen van een samengestelde weergave van cellulaire energie flux. Dit wordt bereikt door een gelijktijdige meting van de warmteafgifte en zuurstof flux gevolgd door een vergelijking van de berekende CR-verhouding met de theoretische oxycaloric gelijkwaardig. Verschillende kritische stappen moeten worden overwogen voor reproduceerbare en betrouwbare gegevens. Het onderh…

Materials

HepG2 Cells	American Type Culture Collection	HB-8065	Cells used for calorespirometry
O2k-Respirometer	Oroboros Instruments	10022-02	Respirometer
LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)	Thermometric AB		Thermometric was purchased by TA Instruments
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermofisher Scientific	11360070	100x solution added to DMEM medium
Fetal Bovine Serum – Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	Added to 10% in DMEM medium
Trypsn-EDTA (0.25%)	Thermofisher Scientific	25200072	Cell dissociation reagent
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich	O4876	Mitochondrial Inhibitor
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920	Mitochondrial Uncoupler
Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning Corporation	430167	Tissue culture dish
Glucose, powder	Thermofisher Scientific	15023021	Glucose for DMEM medium
Galactose, powder	Fischer Scientific	BP656500	Galactose for DMEM medium
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher Scientific	25030081	Glutamine for DMEM medium
DMEM, no glucose	Thermofisher Scientific	11966025	Cell culture medium