Calorespirometry: גישה חזקה, לא פולשנית כדי לחקור את חילוף החומרים האנרגיה התאית
Summary
פרוטוקול זה מתאר calorespirometry, מדידת סימולטני הישירים של פיזור חום וגם נשימה, אשר מספקת גישה לא פולשנית כדי להעריך את חילוף החומרים האנרגיה. טכניקה זו משמשת כדי להעריך את התרומה של מסלולים אירובית וגם אנאירובית כדי ניצול האנרגיה על-ידי ניטור את זרימת האנרגיה התאית הכוללת.
Abstract
שורות תאים רבים השתמשו במחקר ביולוגי וביו בסיסי לשמור על הומאוסטזיס אנרגיה באמצעות שילוב של נשימה אירובית וגם אנאירובית. אולם, במידה שבה שני מסלולים לתרום הנוף של ייצור האנרגיה התאית היא באופן עקבי תסולא בפז. תאים טרנספורמציה תרבותי ב קולח רמות הגלוקוז לעתים קרובות מציגים תלות ירד זרחון חמצוני לייצור ATP, אשר יפוצה על ידי עלייה ברמת סובסטרט זירחון. שינוי זה של פויז מטבולית מאפשר לתאים להתרבות למרות נוכחותם של רעלים מיטוכונדריאלי. בהזנחת שלווה מטבולי שונה של תאים טרנספורמציה, תוצאות של הקרנה התרופות עלול להתפרש מאז פוטנציאל ההשפעות mitotoxic ייתכן לא יזוהו באמצעות מודל שורות תאים בתרבית בנוכחות גלוקוז גבוהות ריכוזים. פרוטוקול זה מתאר הזיווג של שני טכניקות עוצמתיות, respirometry ו- calorimetry, המאפשר להערכת כמותית, לא פולשנית תרומות ייצור ATP תאית אירובית וגם אנאירובית. הנשימות אירובית וגם אנאירובית לייצר חום, אשר יכול להיות תחת פיקוח באמצעות calorimetry. בינתיים, מדידת קצב צריכת החמצן יכול להעריך את מידת נשימה אירובית. כאשר מחממים וגם צריכת החמצן נמדדים בו-זמנית, ניתן לקבוע את היחס calorespirometric. הערך השפעול שהושג לאחר מכן ניתן להשוות את שווי ערך תיאורטי oxycaloric, היקף נשימה אנאירובית יכולה להישפט. לפיכך, calorespirometry מספק שיטה ייחודית לנתח מגוון רחב של שאלות ביולוגיות, לרבות פיתוח תרופות, צמיחת חיידקים ביואנרגיה בסיסי תחת normoxic ותנאים ובשפתיים.
Introduction
במערכות ביולוגיות השינוי שחרור חום או אנתלפיה במהלך חילוף החומרים הוא בדרך כלל תחת פיקוח או ישירות (דרך ישירה calorimetry) או באופן עקיף באמצעות צריכת2 O ו/או ייצור CO2 (דרך respirometry). למרבה הצער, כאשר שיטות אלה משמשים בבידוד, מידע קריטי אובד, כגון התרומה של מסלולים אנאירובית כדי חילוף החומרים הסלולר. Calorespirometry היא טכניקה חזקה המסתמך על המידה בו-זמניות של פיזור חום וגם נשימה. Calorespirometric עבודה חלוצית חקר החומרים אנאירובית בתאי יונקים באופן מלא מחומצן והפגינו תרומות בו זמנית של מסלולים אירובית וגם אנאירובית כדי אנרגיה הומאוסטזה למרות התאים טרנספורמציה להיות הסביבה באופן מלא מחומצן1. Calorespirometry מאז הוחל למגוון רחב של שאלות ביולוגיות. להלן כמה דוגמאות המחקר של בעלי חיים energetics על רמות חמצן נמוכות, את ההשפעות של קוטל עשבים וגם אסטרוגן על הגג של צדפות, חילוף החומרים של האורגניזמים הארציים פירוק מיקרוביאלי של אדמה אורגני משנה2, 3 , 4 , 5 , 6. יתר על כן, יש calorespirometry preconditioning איך מטבולית חשף להקפאה משפר את הקפאה קריוגנית של מידע יונקים תאים7. כל אחד מתקרב, הן calorimetry והן respirometry, באופן עצמאי גדל הידע שלנו על הסלולר, organismal ביואנרגיה. עם זאת, שאלות הביולוגית הבסיסית יכולה לקבל מענה באמצעות calorespirometry נחקרו יחסית.
חוק הס קובע כי השינוי אנתלפיה הכולל של תגובה הוא עצמאי של הנתיב בין המדינות התחלתי וסופי. לדוגמה, השינוי אנתלפיה הכולל מסלול ביוכימי הוא הסיכום של שינוי enthalpies של כל תגובות בתוך מסלול. Calorimetry מציעה גישה בזמן אמת למדידת ייצור החום הסלולר, אשר מזהה ללא הבחנה מסלולים אירובית וגם אנאירובית. זה מבוסס על יסודות כי אין אנרגיה חילופי במערכת חוץ דרך הקירות של האמפולה ניסיוני8. שינוי פיזור חום שווה השינוי באנתלפיה שוחררו כל ריאקציות חילוף האמפולה. לפיכך, אנתלפיה שלילי המתייחס איבוד החום מן המערכת. מחקר מקיף בארבעת העשורים האחרונים יש מאופיין בנוף התרמודינמית של קטבוליזם והן אנאבוליזם. זה מיוצג על ידי עלייה קבועה מאמרי מחקר מצא תחת מילות החיפוש “ביולוגי” ו- “calorimetry” כפי באינדקס על-ידי ארצות הברית הלאומית ספריה של הרפואה (מיסיון)-מכוני הבריאות הלאומיים (PubMed). החיפוש חושף כי לפני 1970, סך של 27 פרסומים הפניה calorimetry ביולוגי; בינתיים, בשנת 2016 לבד, פרסומים 546 ניצלה את הטכניקה.
שיטות calorimetric הן וותיקה כדי לקבוע את ייצור החום. עם זאת, גמישות רבה יותר ניתנת לפתרון הערך respirometric. המדידה respirometric יכולה להיות מורכבת O2, CO2, או O2 והן CO2. עוד יותר, ניתן לבצע את המדידה של O2 או CO2 באמצעות טכניקות שונות, כולל optrodes, אלקטרודות קלארק-סוג של tunable דיודת לייזר לקליטת ספקטרוסקופיה7,9,10 ,11. בעוד הייצור2 CO הוא מדד חשוב במחקרים רבים respirometric, האמצעי עבור תאים בתרבית מנצל לעתים קרובות מערכת מאגר bicarbonic עבור ה-pH שליטה12,13. כדי להימנע מסיבוכים המדידה2 CO למערכת ביקרבונט, פרוטוקול הבאים עבור calorespirometry של תאים בתרבות מנצל O2 כפרמטר respirometric הבלעדית.
בו זמנית עם מדידת שטף חמצן, respirometers מסוימים (ראה טבלה של חומרים) מיועדים הערכות מפורט של פונקציה מיטוכונדריאלי. המצע-uncoupler-מעכב-titrations (סידרה) פרוטוקולים גם הקימה, תואמים ניסויים שנועדו למדוד ממברנה חמצן פוטנציאליים או תגובתי היווצרות מינים (ROS)14. פרוטוקול הציג עבור calorespirometry של תאים שלמים הוא תואם עם כניסתה של uncouplers כימיים כגון קרבוניל ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) ו- F0F1-ATP סינתאז oligomycin מעכב. באמצעות התוספת של FCCP, צריכת חמצן יכול להיות חשיפות מייצור ATP, אשר שימושית להעריך את ההשפעה של פוטנציאל הרפוי peformance מיטוכונדריאלי15. יתר על כן, התוספת של oligomycin מאירה את היקף הדליפה נשימה. לפיכך, המידות respirometric שבוצעה במהלך calorespirometry תואמים פרוטוקולים מקיפה שנועדה בהמשך להסבר מיטוכונדריאלי פיזיולוגיה.
המדד בו זמנית של פיזור חום וגם חמצן השטף מאפשר חישוב היחס calorespirometric (CR). יחס זה מושווה ואז תורנתון קבוע או את עיוני oxycaloric מקביל, שנעה בין-430 כ-480 kJ מול-1 בהתאם שורת תאים או רקמות עניין סובסטרטים שהושלם פחמן1, 16. לפיכך, יחס CR שליליים יותר מגלה תרומות מוגברת של מסלולים אנאירובית לפעילות מטבולית בסך הכל. לדוגמה, יחס CR נשימה רקמת שריר שגרתית ללא הביצועים פעילים של העבודה נע בין-448-468 kJ מול-1 אשר נמצא בטווח עיוני oxycaloric מקביל17,18. בינתיים, תאים סרטניים בתרבית של תרבותי בינוני גבוה גלוקוזה להציג תסיסה הומולקטית משופרת בעקבות גליקוליזה, נמוכה יחסית האירוסין מיטוכונדריאלי19. התוצאה פנוטיפ CR יחסי בטווח של-490 כ-800 kJ מול-1, הממחיש את מעורבות מוגברת של המסלולים אנאירובית בחילוף החומרים הסלולר כמצוין שליליים יותר CR יחסי1,7, 16,20.
מסחרי והן ללא כוונת רווח תאים ורקמות מפיצים כרגע ההצעה שורות תאים מעל 150 מינים, עם קרוב ל-4,000 שורות תאים נגזר מן בני אדם. שורות תאים מונצחים הם כלים נוחים להערכת הרעילות של הרפוי פוטנציאליים, רבים מהם עלולים במישרין או בעקיפין להפריע פונקציות מיטוכונדריאלי במהירות. באמצעות תאים טרנספורמציה במהלך ההקרנה סמים עלולה להיגרם של ערך ניבוי מוגבל בחלק ורבורג, סימן היכר של סרטן רבים. לעתים קרובות, סרטן לייצר ATP מ זרחון ברמת סובסטרט ולתחזק שיווי משקל של חמצון-חיזור דרך הייצור של לקטט בלי מלא מרתקים של מיטוכונדריון תחת תנאים אירוביים19. פיתוח פרמצבטי הוא לשמצה יקר, לא יעיל, עם 8 מתוך 9 תרכובות נבדק בניסויים קליניים האנושי הצליח להשיג אישור השוק21. בעוד הרפוי פוטנציאליות רשאי לעבור ההקרנה הראשונית עקב נמוך cytotoxicity בשורות תאים, זה אפשרי כי כמה תרכובות אלה הן mitotoxic. ללא שיטה מתאימה כדי לזהות כמה רעלים אלו עלול לפגום את מאזן האנרגיה בתאים הראשי אינם מציגים ורבורג, מידע קריטי לעתים קרובות נראה יתר על המידה, bottlenecking טיפולית פיתוח בשלבים מוקדמים.
Calorespirometry היא גישה מעשית, לא פולשנית לנתח פעילות חילוף החומרים במגוון של דגימות ביולוגיות, כולל תאים ורקמות. הליבה של פרוטוקול הציג הוא תואם עם מגוון רחב של יישומים. בעיה אחת, עם זאת, זוהתה. תאים מונצח לעיתים קרובות מתורבתים במדיום נטול גלוקוז בתוספת גלקטוז להגדיל את התרומה של זרחון חמצוני (OXPHOS) לייצור אנרגיה, על מנת לרגש לתאים mitotoxins פוטנציאליים22, 23. הזו מטבולי התכנות מופיע המעורפלים ניתוח כאשר דגימות ממוקמות על ampules פלדת אל-חלד בשימוש על ידי ה קלורימטר15. תאים תרבותי במדיום גלוקוז ממשיכים לעסוק פעילות מטבולית גבוהה למשך מספר שעות. בינתיים, תאים תרבותי במדיום גלקטוז להקטין את ייצור החום בתוך 30 דקות של שלהם השמה האמפולה, ביצוע מדידות מוגבל לנקודות זמן בתחילת הניסוי. התנהגות זו, למרבה הצער, מעכבת את ההזדמנות כדי להעריך את התפשטות הסלולר שלהם. למרות מגבלה ספציפית זו, מרבית היישומים עולים בקנה אחד עם ניתוח calorespirometric, ניתן לקבל מידע מפורט מטבולית באמצעות גישה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטרה של calorespirometry היא באופן כמותי להעריך את תרומתם של מסלולים ואנאירוביים לפעילות מטבולית ולקבל תצוגה ללא הפרדות צבע של שטף האנרגיה התאית. זו מושגת על ידי מידת פיזור חום, שטף חמצן ואחריו השוואה של היחס CR מחושב עם oxycaloric תיאורטי מקביל בו זמנית. יש לקחת בחשבון מספר שלבים קריטיים עבור נתונים א?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן בחלקו על ידי המענק הלאומית למדע צ’ה-160944 מרי דגלס Konkle, מייקל א Menze.
Materials
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum – Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
- Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology – Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
- Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
- Gnaiger, E., Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. , 149-171 (1991).
- Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
- Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
- Webb, P. . Human Calorimetry. , (1985).
- Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
- Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
- Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
- Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
- Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
- Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
- Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
- Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
- Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
- Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Recherche en cancérologie. 64, 985-993 (2004).
- Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).
