كالوريسبيروميتري: اتباع نهج موسع، قوية للتحقيق في استقلاب الطاقة الخلوية
Summary
ويصف هذا البروتوكول كالوريسبيروميتري، والقياس المباشر والمتزامن لتبديد الحرارة والتنفس، والتي تنص على اتباع نهج موسع لتقييم الطاقة الأيض. يتم استخدام هذا الأسلوب لتقييم مساهمة الممرات الهوائية واللاهوائية على حد سواء لاستخدام الطاقة عن طريق رصد تدفق إجمالي الطاقة الخلوية.
Abstract
العديد من خطوط الخلايا المستخدمة في الأبحاث البيولوجية والطبية الأساسية الحفاظ على التوازن الطاقة من خلال مزيج من التنفس الهوائي واللاهوائي على السواء. ومع ذلك، مدى إسهام كل المسارات في المناظر الطبيعية لإنتاج الطاقة الخلوية التغاضي عن استمرار. تحول الخلايا المستزرعة في تشبع مستويات الجلوكوز في كثير من الأحيان إظهار تبعية انخفاض في الفسفرة لإنتاج ATP، والتي عوضت زيادة في مستوى الركازة الفسفرة. ويسمح هذا التحول في الأيض اتزان الخلايا تنتشر على الرغم من وجود السموم المتقدرية. في إهمال اتزان الأيضية تغيير الخلايا المحولة، قد يساء تفسير نتائج فحص الأدوية منذ يحتمل أن تكون الآثار ميتوتوكسيك قد لا يمكن الكشف عنها باستخدام خطوط الخلايا نموذج مثقف حضور الجلوكوز عالية تركيزات. ويصف هذا البروتوكول الاقتران من اثنين من التقنيات القوية، ريسبيروميتري، والقياس، مما يسمح للتقييم الكمي وموسع للمساهمات سواء الهوائية أو اللاهوائية لإنتاج ATP الخلوي. ريسبيريشنز الهوائية واللاهوائية على حد سواء توليد الحرارة، التي يمكن رصدها عن طريق القياس. ومن ناحية أخرى، يمكن قياس معدل استهلاك الأوكسجين إلى تقييم مدى التنفس الهوائي. عندما يتم قياس الفقد الحراري واستهلاك الأكسجين في نفس الوقت، يمكن تحديد نسبة كالوريسبيروميتريك. يمكن بعد ذلك مقارنة القيمة التي تم الحصول عليها تجريبيا إلى أوكسيكالوريك نظرية تعادل ويمكن الحكم على مدى التنفس اللاهوائي. وهكذا، كالوريسبيروميتري يوفر طريقة فريدة لتحليل طائفة واسعة من المسائل البيولوجية، بما في ذلك تطوير العقاقير والنمو الميكروبي والاستقلاب الأساسية تحت نورموكسيك وظروف التاكسج.
Introduction
في الأنظمة البيولوجية، تغير الحرارة-الإصدار أو محتوى حراري أثناء التمثيل الغذائي عادة رصد أما مباشرة (عن طريق القياس المباشر) أو غير مباشر عن طريق استهلاك2 س و/أو إنتاج2 CO (عبر ريسبيروميتري). لسوء الحظ، عندما تستخدم هذه التقنيات بمعزل عن غيرها، المعلومات الهامة المفقودة، مثل مساهمة مسارات اللاهوائية الأيض الخلوية. كالوريسبيروميتري هي تقنية قوية تعتمد على قياس المتزامنة لتبديد الحرارة والتنفس. كالوريسبيروميتريك أعمال رائدة التحقيق الأيض اللاهوائي في خلايا الثدييات اﻷوكسيجين تماما وأظهرت المساهمات المتزامنة للممرات الهوائية واللاهوائية على حد سواء إلى التوازن الطاقة على الرغم من الخلايا المحولة يجري في 1من البيئة اﻷوكسيجين تماما. منذ ذلك الحين طبق كالوريسبيروميتري على طائفة واسعة من المسائل البيولوجية. وتشمل بعض الأمثلة على دراسة علم الطاقة الحيوانية في مستويات منخفضة الأكسجين، وآثار مبيدات الأعشاب والاستروجين في الخياشيم ذات الصدفتين والتمثيل الغذائي للكائنات الأرضية والتحلل الميكروبي للتربة العضوية هذه المسألة2، 3 , 4 , 5 , 6-وعلاوة على ذلك، قد كالوريسبيروميتري preconditioning الأيضية كيف كشفت قبل تجميد يحسن نعد الثدييات خلايا7. كل نهج، القياس وريسبيروميتري، وقد ازداد بشكل مستقل معرفتنا بالاستقلاب الخلوي والعضوي. ومع ذلك، تظل الأسئلة البيولوجية الأساسية التي يمكن الإجابة عن طريق استخدام كالوريسبيروميتري غير مستكشفة نسبيا.
القانون في هيس تنص على أن تغيير إجمالي محتوى حراري رد فعل مستقل عن المسار بين الدول الأولية والنهائية. على سبيل المثال، تغيير مجموع المحتوى الحراري لمسار الكيمياء الحيوية هو مجموع التغير في انثالبيس لجميع ردود الفعل داخل المسار. القياس يقدم نهجاً في الوقت الحقيقي لقياس إنتاج الحرارة الخلوية، مما يكشف الممرات الهوائية واللاهوائية على حد سواء دون تمييز. ويستند هذا على أساس أن يتم تبادل لا الطاقة في النظام إلا من خلال الجدران ampule التجريبية8. تغيير في تبديد الحرارة من مساوياً للتغيير في محتوى حراري صدر من جميع التفاعلات الأيضية في أمبولي. وهكذا، يرتبط محتوى حراري سلبي إلى فقدان الحرارة من النظام. أبحاث مستفيضة على مدى العقود الأربعة الماضية اتسم المشهد دينامي حراري الانتقاض وابتناء. ويمثل هذا ارتفاع مطرد في المقالات والبحوث الموجودة تحت مصطلحات البحث “البيولوجية” و “القياس” كما فهرستها بالولايات المتحدة الوطنية مكتبة للطب (NLM) في “المعاهد الوطنية للصحة” (PubMed). البحث يكشف عن أنه قبل عام 1970، ما مجموعة 27 المنشورات المرجعية القياس البيولوجي؛ وفي الوقت نفسه، استخدمت المنشورات 546 في عام 2016 وحدها، التقنية.
أساليب المسعريه راسخة لتحديد إنتاج الحرارة. ومع ذلك، يمنح قدرا أكبر من المرونة لحسم قيمة ريسبيروميتريك. يمكن أن تتكون بقياس ريسبيروميتريك من س2،2من أول أكسيد الكربون، أو كل من س2 و CO2. علاوة على ذلك، يمكن به قياس س2 أو CO2 تقنيات مختلفة، بما في ذلك أوبتروديس وكهربائي من نوع كلارك والانضباطي صمام ثنائي ليزر الامتصاص الطيفي7،9،10 ،11. المتوسطة للخلايا المستزرعة أثناء إنتاج2 CO مقياس قيمة في كثير من الدراسات ريسبيروميتريك، كثيرا ما يستخدم نظام المخزن مؤقت بيكاربونيك لدرجة الحموضة التحكم12،13. لتجنب المضاعفات الناجمة عن قياس2 CO في النظام بيكربونات، يستخدم البروتوكول التالي كالوريسبيروميتري الخلايا في ثقافة س2 كمعلمة ريسبيروميتريك الوحيد.
وبالتزامن مع قياس تدفق الأكسجين، ريسبيروميتيرس معينة (انظر الجدول للمواد) مصممة لتقييمات مفصلة للوظيفة المتقدرية. بروتوكولات (كوي) الركيزة-أونكوبلير-مثبط-معايرات هي راسخة ومتوافقة مع تجارب مصممة لقياس غشاء الأكسجين المحتملة أو رد الفعل الأنواع (روس) تشكيل14. البروتوكول المقدم من أجل كالوريسبيروميتري خلايا سليمة متوافق مع مقدمة أونكوبليرس الكيميائية مثل الكربونيل السيانيد-فتريفلوروميثوكسيفينيلهيدرازوني (فككب) وأوليجوميسين و0و1-ATP synthase المانع. عن طريق إضافة فككب، يمكن أن يكون استهلاك الأكسجين أونكوبليد من إنتاج ATP، ومفيدة تقييم أثر العلاجات المحتملة على أداء المتقدرية15. وعلاوة على ذلك، إضافة أوليجوميسين ينير مدى تسرب للتنفس. وهكذا، ريسبيروميتريك القياسات التي يتم إجراؤها أثناء كالوريسبيروميتري متوافقة مع البروتوكولات واسعة النطاق تهدف إلى توضيح فسيولوجيا المتقدرية.
يسمح قياس المتزامن لتبديد الحرارة وتدفق الأكسجين لحساب نسبة كالوريسبيروميتريك (الجمهورية التشيكية). ثم تتم مقارنة هذه النسبة ثورنتون الثابت أو أوكسيكالوريك نظرية تعادل، التي تتراوح بين-430 إلى-480 kJ mol-1 استناداً إلى خط الخلية أو النسيج لمصلحة و ركائز الكربون المكملة1، 16. وهكذا، يكشف نسبة CR أكثر سلبية زيادة المساهمات من مسارات اللاهوائية للنشاط الأيضي عموما. على سبيل المثال، تتراوح نسبة CR تنفس أنسجة العضلات الروتينية دون أداء العمل النشط-448-468 kJ mol-1 التي تدخل في نطاق ما يعادل17،أوكسيكالوريك النظري18. وفي الوقت نفسه، الخلايا السرطانية الثديية مثقف في المتوسط هو ارتفاع في مستوى السكر في عرض تخمير حمض الالكتيك المعزز عقب تحلل والمنخفضة نسبيا لمشاركة المتقدرية19. نتائج هذا النمط الظاهري في نسب CR في النطاق من-490 إلى-800 كيلو جول مول-1، مما يدل على تزايد مشاركة مسارات اللاهوائية في الأيض الخلوية كما أشار إلى ذلك أكثر سلبية CR نسب1،7، ،من 1620.
الموزعين على حد سواء تجارية وغير هادفة للربح الخلايا والأنسجة حاليا خطوط الخلايا العرض من أكثر من 150 نوعا، مع ما يقرب من 4,000 من خطوط الخلايا المستمدة من البشر. خطوط خلية مخلدة هي أدوات ملائمة لتقييم سمية المداواة المحتملين، كثير منها قد مباشر أو غير مباشر تتداخل مع مهام المتقدرية بسرعة. باستخدام الخلايا المحولة خلال فحص المخدرات قد تكون محدودة القيمة التنبؤية جزئيا بسبب تأثير واربورغ، سمة مميزة لكثير من أنواع السرطان. في كثير من الأحيان، سرطانات توليد ATP من الركازة المستوى الفسفرة والحفاظ على توازن الأكسدة والاختزال من خلال إنتاج لاكتات دون الانخراط الكامل في ميتوكندريا تحت الظروف الهوائية19. تطوير المستحضرات الصيدلانية المعروف مكلفة وغير فعالة، مع ما يقرب من 8 من أصل 9 مركبات اختبارها في التجارب السريرية البشرية عاجزة عن تحقيق السوق الموافقة على21. بينما العلاجات المحتملة قد تمر الفحص الأولى بسبب انخفاض سيتوتوكسيسيتي في خطوط الخلايا، فمن الممكن أن بعض هذه المركبات ميتوتوكسيك. دون وسيلة مناسبة للكشف عن كيف يمكن أن يعوق هذه السموم ميزان الطاقة في الخلايا الأولية التي لا يتم عرض تأثير واربورغ، المعلومات الهامة غالباً ما بدأ الإفراط، bottlenecking التنمية العلاجية في المراحل المبكرة.
كالوريسبيروميتري نهج عملي موسع لتحليل النشاط الأيضي في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية، بما في ذلك الخلايا والأنسجة. جوهر البروتوكول عرض متوافق مع مجموعة من التطبيقات. ومع ذلك، حددت واحدة من المضاعفات،. وكثيراً ما تستزرع خلايا مخلدة في متوسط خالية من السكر وتستكمل مع اللبن لزيادة مساهمة الفسفرة (أوكسفوس) لإنتاج الطاقة، من أجل توعية الخلايا المحتملة ميتوتوكسينس22، 23. هذا إعادة برمجة الأيضية ويبدو أن يحجب التحليل عند وضع العينات في امبولات الفولاذ المقاوم للصدأ تستخدم قبل مسعر15. الخلايا المزروعة في متوسط جلوكوز مواصلة الانخراط في النشاط الأيضي عالية لعدة ساعات. وفي الوقت نفسه، الخلايا المستزرعة في المتوسط اللبن انخفاض إنتاج الحرارة داخل 30 دقيقة من وضعهم في أمبولي، مما يجعل قياسات تقتصر على النقاط الزمنية التجريبية المبكرة. ويعوق هذا السلوك، لسوء الحظ، الفرصة لتقييم انتشارها الخلوية. وعلى الرغم من هذا القيد محددة، معظم تطبيقات متوافقة مع التحليل كالوريسبيروميتريك ويمكن الحصول على معلومات مفصلة الأيضية عن طريق هذا النهج.
Protocol
Representative Results
Discussion
كالوريسبيروميتري يهدف إلى تقييم كمي مساهمات الممرات الهوائية واللاهوائية للنشاط الأيضي والحصول على صورة مركبة لتدفق الطاقة الخلوية. يتم ذلك عن طريق قياس متزامن لتبديد الحرارة وتدفق الأوكسجين تليها مقارنة مع أوكسيكالوريك نظرية تعادل نسبة CR المحسوبة. يجب النظر في عدة خطوات حاسمة لبيانات …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل جزئيا بمنحه “مؤسسة العلوم الوطنية” تشي-160944 كونكلي هاء ماري ومايكل ألف منز.
Materials
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum – Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
- Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology – Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
- Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
- Gnaiger, E., Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. , 149-171 (1991).
- Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
- Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
- Webb, P. . Human Calorimetry. , (1985).
- Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
- Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
- Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
- Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
- Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
- Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
- Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
- Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
- Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
- Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Recherche en cancérologie. 64, 985-993 (2004).
- Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).
