Calorespirometry: En kraftfuld, Noninvasive tilgang at undersøge cellulære energimetabolisme

Summary

Denne protokol beskriver calorespirometry, direkte og samtidig måling af både varmeafledning og respiration, som giver noninvasive tilgang for at vurdere energimetabolisme. Denne teknik bruges til at vurdere bidraget fra både aerobe og anaerobe veje til energi udnyttelse ved at overvåge den samlede cellulære energi flow.

Abstract

Mange cellelinjer anvendes i grundlæggende biologiske og biomedicinsk forskning opretholde energi homeostase gennem en kombination af både aerobe og anaerobe respiration. Det omfang, som begge veje bidrage til landskabet af cellulære energiproduktion er imidlertid konsekvent overset. Transformerede celler dyrkes i mætte niveauer af glukose ofte vise en nedsat afhængighed på oxidativ fosforylering for ATP produktion, der er udlignet af en stigning i substrat-niveau fosforylering. Dette skift i metaboliske poise tillader celler til at formere sig på trods af tilstedeværelsen af mitokondrie toksiner. I forsømme den ændrede metaboliske poise af transformerede celler, resultater fra en farmaceutisk screening kan mistolkes siden den potentielt mitotoxic virkninger kan ikke påvises ved hjælp af model cellelinjer kulturperler i overværelse af høje glukose koncentrationer. Denne protokol beskriver bindingen af to kraftfulde teknikker, respirometri og kalorimetri, som giver mulighed for kvantitative og noninvasive vurdering af både aerobe og anaerobe bidrag til cellulære ATP produktion. Både aerobe og anaerobe respirations generere varme, som kan blive overvåget via kalorimetri. I mellemtiden, måle hastigheden af iltforbrug kan vurdere omfanget af aerob respiration. Når både varmeafledning og iltforbruget måles samtidigt, kan calorespirometric forholdet bestemmes. Den eksperimentelt opnåede værdi kan derefter sammenlignes med den teoretiske oxycaloric tilsvarende og omfanget af den anaerobe respiration kan bedømmes. Således giver calorespirometry en unik metode til at analysere en bred vifte af biologiske spørgsmål, herunder udvikling af lægemidler, mikrobiel vækst og grundlæggende bioenergetik under både normoxic og hypoksiske betingelser.

Introduction

I biologiske systemer, den varme-release eller enthalpi ændring under stofskiftet er typisk overvåges enten direkte (via direkte kalorimetri) eller indirekte via O₂ forbrug og/eller CO₂ produktion (via respirometri). Desværre, når disse teknikker anvendes i isolation, kritiske oplysninger går tabt, såsom bidrag af anaerobe veje til cellulære metabolisme. Calorespirometry er en effektiv teknik, der bygger på den samtidige måling af både varmeafledning og respiration. Calorespirometric pionerarbejde undersøgt det anaerobe stofskifte i fuldt iltet pattedyrceller og demonstreret samtidige bidrag af både aerobe og anaerobe veje til energi homøostase trods de transformerede celler er i en fuldt iltet miljø¹. Calorespirometry er siden blevet anvendt til en bred vifte af biologiske spørgsmål. Nogle eksempler kan nævnes studiet af dyrs energetik på lavt iltindhold, virkningerne af både herbicid og østrogen på gællerne af muslinger, metabolismen af terrestriske organismer og mikrobielle nedbrydning af organisk jord sag^{2, 3 , 4 , 5 , 6}. calorespirometry har desuden afsløret hvordan metaboliske forkonditionering før frysning forbedrer kryopræservering af pattedyr celler⁷. Hver tilgang, både kalorimetri og respirometri, selvstændigt har øget vores viden om cellulært og kropsligt bioenergetik. Grundlæggende biologiske spørgsmål, der kan besvares ved hjælp af calorespirometry er dog stadig relativt uudforsket.

Hesss lov fastslår, at den samlede enthalpi ændring af en reaktion er uafhængig af vej mellem første og sidste. F.eks. den samlede enthalpi ændring for en biokemisk pathway er summen af ændringen i enthalpies af alle reaktioner i vejen. Kalorimetri tilbyder en real-time tilgang til måling af cellulære varmeproduktion, som ukritisk registrerer både aerobe og anaerobe veje. Dette er baseret på det fundament, at ingen energi udveksles i systemet undtagen gennem væggene af de eksperimentelle ampule⁸. En ændring i varmeafledning er lig med ændringen i enthalpi frigivet fra alle metaboliske reaktioner i ampule. Således, en negativ enthalpi korrelerer til et tab af varme fra systemet. Udtømmende forskning i de sidste fire årtier har karakteriseret den termodynamiske landskab af både katabolisme og anabolisme. Dette er repræsenteret ved en støt stigning i forskningsartikler fundet under søgeudtryk “biologiske” og “Calorimetri” som indekseret af USA ‘s nationale bibliotek af Medicine (NLM) på National Institutes of Health (PubMed). Søgningen viser sig før 1970, ialt 27 publikationer reference biologiske kalorimetri; i mellemtiden, i 2016 alene, 546 publikationer udnyttet teknikken.

Kolorimetriske metoder er veletableret at bestemme varmeproduktion. Dog gives mere fleksibilitet til at løse den respirometric værdi. Respirometric måling kan bestå af O₂, CO₂, eller både O₂ og CO₂. Yderligere, måling af O₂ eller CO₂ kan opnås ved hjælp af forskellige teknikker, herunder optrodes, Clark-type elektroder og afstemmelige diode laser absorption spektroskopi^{7,9,10 ,11}. Mens CO₂ produktion er en værdifuld måling i mange respirometric undersøgelser, udnytter medium for kulturperler celler ofte en bicarbonic buffersystem for pH kontrol^12,13. For at undgå komplikationer af CO₂ måling i ordningen bikarbonat, udnytter følgende protokol for calorespirometry af celler i kultur O₂ som den eneste respirometric parameter.

Samtidige med at måle ilt flux, visse respirometers (Se Tabel af materialer) er designet til detaljerede vurderinger af mitokondrie-funktionen. Substrat-uncoupler-inhibitor-titreringer (SUIT) protokoller er veletableret og er forenelige med forsøg på at måle membran potentielle eller reaktive ilt arter (ROS) dannelse¹⁴. Den præsenterede protokol for calorespirometry af intakt celler er kompatibel med indførelsen af kemiske uncouplers såsom carbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) og F₀F₁-ATP syntase hæmmer oligomycinets. Gennem tilsætning af FCCP, kan iltforbrug være frakoblet fra ATP produktion, som er nyttige til at vurdere virkningen af potentielle therapeutics mitokondrie indvinding¹⁵. Derudover belyser tilføjelsen af oligomycinets omfanget af lækage respiration. Således er respirometric målingerne udføres under calorespirometry kompatibel med omfattende protokoller designet til yderligere belyse mitokondrie fysiologi.

Samtidig måling af både varmeafledning og ilt flux giver mulighed for beregning af calorespirometric (CR) forholdet. Dette forhold er derefter sammenlignet med den Thornton konstant eller den teoretiske oxycaloric tilsvarende, som svinger mellem-430 til-480 kJ mol^-1 afhængig af cellelinie eller væv af interesse og supplerede carbon substrater^{1, 16}. således er forholdet mere negative CR afslører øgede bidrag fra anaerob veje til samlet metaboliske aktivitet. For eksempel, spænder CR-forholdet for rutinemæssig muskel væv respiration uden aktive udførelsen af arbejdet fra-448 til-468 kJ mol-1, som er inden for rækkevidde af de teoretiske oxycaloric svarende^17,18. I mellemtiden, pattedyr kræftceller kulturperler i medium, der er højt indhold af glucose vise forbedrede mælkesyre gæring efter glykolyse og lav relativt mitokondrie engagement¹⁹. Denne fænotype resultater i CR nøgletal i rækken af-490 at-800 kJ mol^-1, demonstrere en øget inddragelse af den anaerobe veje i den cellulære metabolisme som anført af mere negative CR nøgletal^{1,7, 16,20}.

Både kommercielle og almennyttige celle og væv distributører i øjeblikket tilbud cellelinjer fra over 150 arter, med næsten 4.000 cellelinjer afledt af mennesker. Udødeliggjort cellelinjer er praktiske værktøjer for hurtigt vurdering af toksiciteten af potentielle therapeutics, hvoraf mange kan direkte eller indirekte forstyrre mitokondriets funktioner. Ved hjælp af transformerede celler under stof screening kan være af begrænset prædiktive værdi delvis på grund af effekten Warburg, kendetegnende for mange kræftformer. Ofte, kræftformer generere ATP fra substrat-niveau fosforylering og opretholde redox balance gennem produktion af laktat uden fuldt engagerende mitochondriet under aerobe betingelser¹⁹. Farmaceutisk udvikling er notorisk bekostelig og ineffektiv, med ca 8 ud af 9 forbindelser afprøvet i humane kliniske forsøg ikke at opnå marked godkendelse²¹. Mens potentielle therapeutics kan passere indledende screening på grund af lav cytotoksicitet i cellelinjer, er det muligt, at nogle af disse forbindelser er mitotoxic. Uden en passende metode til at påvise, hvordan disse toksiner kan forringe energibalancen i primærelementer, der ikke viser effekten Warburg, er kritiske oplysninger ofte over kiggede, flaskehalsproblemer terapeutisk udvikling i tidlige stadier.

Calorespirometry er en praktisk, noninvasive tilgang til at analysere metaboliske aktivitet i en bred vifte af biologiske prøver, herunder celler og væv. Kernen i den præsenterede protokol er kompatibel med en række applikationer. En komplikation, men er blevet identificeret. Udødeliggjort celler er ofte dyrkes i en glucose-frit medium suppleret med galactose at øge bidraget fra oxidativ fosforylering (OXPHOS) til energiproduktion, for at bevidstgøre celler til potentielle mitotoxins^{22, 23}. Denne metabolisk omprogrammering synes at overskygge analyse når prøverne er placeret i rustfrit stål ampuller bruges af NA48-¹⁵. Celler dyrkes i en glucose medium fortsat at engagere sig i høje metaboliske aktivitet i flere timer. I mellemtiden, celler dyrkes i galactose medium formindske varmeproduktion inden for 30 min. af deres placering i ampule, at foretage målinger begrænset til tidlige eksperimenterende tidspunkter. Denne adfærd, hindrer desværre, mulighed for at vurdere deres cellulære spredning. Trods denne særlige begrænsninger, de fleste programmer er kompatible med calorespirometric analyse og metaboliske oplysninger kan opnås ved denne tilgang.

Protocol

1. cellekultur Vedligeholde menneskelige hepatocellulært carcinom (HepG2) celler i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) som indeholder 10% føtal bovint serum (FBS) og yderligere substrater (10 mM glukose, 2 mM glutamin og 1 mM pyruvat) ved 37 ° C i en celle kultur inkubator (5% CO2 , 95% luft, 100% fugtighed).Bemærk: Brug ovenstående DMEM formulering, når DMEM der henvises til i senere trin for respirometri og kalorimetri. Plade celler på 1 x 106 celler pr. 100 m…

Representative Results

Reproducerbarhed af calorespirometric målinger afhænger af en korrekt og konsekvent prøveforberedelse. Prøver forberedt fra cellekultur bør ikke anvendes hvis pladerne er tilgroet, da celletal kan blive unøjagtig på grund af sammenklumpning. Yderligere, reduceret varme strømme på grund af begrænset substrat diffusion i klumpet cellerne kan forekomme. Når du bruger vedhængende celler, er det derfor afgørende at vælge en plade med confluency mellem 60-80% og ændre medium 24 timer forud for forsøget. <p …

Discussion

Formålet med calorespirometry er at kvantitativt vurdere bidragene fra aerobe og anaerobe veje til metaboliske aktivitet og få et sammensat billede af cellulære energi flux. Dette opnås ved en samtidig måling af varmeafledning og ilt flux efterfulgt af en sammenligning af de beregnede CR forholdet med den teoretiske oxycaloric tilsvarende. Flere kritiske trin skal anses for reproducerbare og pålidelige data. Vedligeholdelse af en steril, sund cellekultur er kritisk. Forurening med bakterier eller svampe kan resulte…

Materials

HepG2 Cells	American Type Culture Collection	HB-8065	Cells used for calorespirometry
O2k-Respirometer	Oroboros Instruments	10022-02	Respirometer
LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)	Thermometric AB		Thermometric was purchased by TA Instruments
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermofisher Scientific	11360070	100x solution added to DMEM medium
Fetal Bovine Serum – Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	Added to 10% in DMEM medium
Trypsn-EDTA (0.25%)	Thermofisher Scientific	25200072	Cell dissociation reagent
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich	O4876	Mitochondrial Inhibitor
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920	Mitochondrial Uncoupler
Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning Corporation	430167	Tissue culture dish
Glucose, powder	Thermofisher Scientific	15023021	Glucose for DMEM medium
Galactose, powder	Fischer Scientific	BP656500	Galactose for DMEM medium
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher Scientific	25030081	Glutamine for DMEM medium
DMEM, no glucose	Thermofisher Scientific	11966025	Cell culture medium