Calorespirometry: Eine starke, nicht-invasive Ansatz zur zellulären Energiestoffwechsel untersuchen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Calorespirometry, die direkte und gleichzeitige Messung der Wärmeableitung und Atmung, sorgt für eine nicht-invasive Ansatz um den Energiestoffwechsel zu beurteilen. Diese Technik wird verwendet, um den Beitrag von aeroben und anaeroben Wege zur energetischen Nutzung durch die Überwachung des gesamten zellulären Energiefluss zu bewerten.
Abstract
Viele Zelllinien verwendet in der biologischen und biomedizinischen Grundlagenforschung pflegen energiehomöostase durch eine Kombination von aeroben und anaeroben Atmung. Allerdings ist der Umfang, den beide Wege zur Landschaft der zellulären Energieproduktion beitragen, konsequent übersehen. Transformierte Zellen kultiviert in Sättigung Niveaus der Glukose oft zeigen eine geringere Abhängigkeit auf Oxidative Phosphorylierung für ATP-Produktion, die durch eine Erhöhung der Substrat-Niveau Phosphorylierung ausgeglichen wird. Diese Verschiebung in der metabolischen Gleichgewicht ermöglicht Zellen, trotz der Anwesenheit der mitochondrialen Toxine vermehren. In veränderten Stoffwechsel Haltung der transformierten Zellen zu vernachlässigen, Ergebnisse von pharmazeutischen Prüfung können fehlinterpretiert werden, seit der potenziell Mitotoxic Effekte können nicht erkannt werden mit Modell Zelllinien kultiviert in Anwesenheit hoher Blutzucker Konzentrationen. Dieses Protokoll beschreibt die Paarung von zwei mächtigen Techniken, respirometrie und Kalorimetrie, die für die quantitative und nicht-invasive Beurteilung der aeroben und anaeroben Beiträge zur zellulären ATP-Produktion ermöglicht. Aerobe und anaerobe Atmungen erzeugen Wärme, die überwachten über Kalorimetrie sein kann. Unterdessen kann die Messrate der Sauerstoffverbrauch der aeroben Atmung, inwieweit. Wenn Wärmeableitung und Sauerstoffverbrauch gleichzeitig gemessen werden, kann das Verhältnis der Calorespirometric bestimmt werden. Die experimentell ermittelten Wert kann dann verglichen werden, um die theoretische Oxycaloric gleichwertig und das Ausmaß der anaeroben Atmung beurteilt werden kann. So bietet Calorespirometry eine einzigartige Methode, um eine Vielzahl von biologischen Fragen, einschließlich der Arzneimittelentwicklung, mikrobielles Wachstum und grundlegende Bioenergetik unter Inklusieve und hypoxischen Bedingungen zu analysieren.
Introduction
In biologischen Systemen, die Wärmeabgabe oder Enthalpie Änderung beim Stoffwechsel ist in der Regel entweder direkt überwacht (über direkte Kalorimetrie) oder indirekt über O2 Verbrauch und/oder CO-2 -Produktion (über respirometrie). Wenn diese Techniken isoliert verwendet werden, ist leider wichtige Informationen verloren gehen, wie der Beitrag von anaeroben Wege zur zellulären Stoffwechsel. Calorespirometry ist eine leistungsstarke Technik, die auf die gleichzeitige Messung der Wärmeableitung und die Atmung setzt. Calorespirometric Pionierarbeit den anaeroben Stoffwechsel im voll sauerstoffreiches Säugerzellen untersucht und demonstriert gleichzeitig Beiträge von aeroben und anaeroben Wege zur Energie-Homöostase trotz der transformierten Zellen in einer voll oxydierten Umgebung1. Calorespirometry wurde inzwischen zu einer Vielzahl von biologischen Fragestellungen angewandt. Beispiele hierfür sind die Untersuchung von tierischen Energetik bei niedrigen Sauerstoffgehalt, die Auswirkungen der Herbizid und Östrogen auf den Kiemen der Muscheln, der Stoffwechsel der terrestrischen Organismen und den mikrobiellen Abbau von organischen Böden Angelegenheit2, 3 , 4 , 5 , 6. Calorespirometry hat7Zellen offenbarte wie metabolische Vorkonditionierung vor dem Einfrieren der Kryokonservierung von Säugetieren verbessert. Jeder Ansatz, Kalorimetrie und respirometrie, hat selbständig erhöht unser Wissen über zelluläre und organismal Bioenergetik. Relativ unerforscht bleiben jedoch grundlegende biologische Fragestellungen, die durch den Einsatz von Calorespirometry beantwortet werden können.
Hesss Gesetz besagt, dass die totale Enthalpieänderung der Reaktion des Weges zwischen dem Anfangs- und Endwert Staaten unabhängig ist. Beispielsweise ist die gesamte Enthalpieänderung für einen biochemischen Weg die Summierung der Änderung der Enthalpien aller Reaktionen innerhalb der Weg. Kalorimetrie bietet einen Echtzeit-Ansatz zur Messung der zellulären Wärmeerzeugung, die wahllos aerobe und anaerobe Wege erkennt. Dies basiert auf der Grundlage, dass keine Energie in das System außer durch die Wände des experimentellen Ampulle8ausgetauscht werden. Eine Änderung der Wärmeableitung ist gleich der Änderung im Enthalpie befreit alle Stoffwechselreaktionen in der Ampulle. So korreliert eine negative Enthalpie zu einem Verlust von Wärme aus dem System. Umfassende Forschung in den letzten vier Jahrzehnten hat die thermodynamische Landschaft von Anabolismus und Katabolismus geprägt. Dies wird durch einen stetigen Anstieg der Fachartikel finden Sie unter den Suchbegriffen “biologisch” und “Kalorimetrie” wie durch die Vereinigten Staaten nationale Bibliothek von Medicine (NLM) an den National Institutes of Health (PubMed) indiziert dargestellt. Die Suche zeigt, dass vor 1970, insgesamt 27 Publikationen Referenz biologische Kalorimetrie; Unterdessen in 2016 allein verwendet 546 Publikationen die Technik.
Kalorimetrischer Methoden sind etabliert, Wärmeerzeugung zu bestimmen. Für die Lösung des respirometric Wert wird jedoch mehr Flexibilität gewährt. Die respirometric Messung kann von O2, CO2, oder O2 und CO2bestehen. Darüber hinaus kann die Messung der O2 oder CO2 durch verschiedene Techniken, einschließlich Optrodes, Clark-Art Elektroden und tunable Diode Laser Absorption Spektroskopie7,9,10 erfolgen ,11. Während CO2 -Produktion eine wertvolle Metrik in vielen respirometric Studien ist, nutzt das Medium für kultivierten Zellen oft ein Bicarbonic Puffersystem für pH Steuerung12,13. Zur Vermeidung von Komplikationen der CO2 -Messung in das Bicarbonat-System nutzt das folgende Protokoll für die Calorespirometry der Zellen in Kultur O2 als alleinige respirometric Parameter.
Gleichzeitig mit der Messung von Sauerstoff-Fluss, sind bestimmte Respirometers (siehe Tabelle der Materialien) für detaillierte Bewertungen der mitochondrialen Funktion ausgelegt. Substrat-Entkuppler-Inhibitor-Titrationen (Anzug) Protokolle sind etabliert und sind kompatibel mit Experimenten Membran potenzielle oder reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) Bildung14messen soll. Die vorgestellte Protokoll für Calorespirometry der intakten Zellen ist kompatibel mit der Einführung der chemischen Entkuppler wie Carbonyl Zyanid-p-Trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) und F0F1-ATP-Synthase Oligomycin Hemmstoff. Durch die Zugabe von FCCP können Sauerstoffverbrauch abgekoppelt von der ATP-Produktion, zur Bewertung der Auswirkungen von potenziellen Therapeutika auf mitochondriale Leistung15nützlich ist. Darüber hinaus beleuchtet die Zugabe von Oligomycin das Ausmaß der Undichtigkeit Atmung. So sind die respirometric Messungen während Calorespirometry kompatibel mit umfangreiche Protokolle entwickelt, um weitere mitochondriale Physiologie aufzuklären.
Die gleichzeitige Messung der Wärmeableitung und Sauerstoff Flussmittel kann für die Berechnung des Calorespirometric (CR)-Verhältnisses. Dieses Verhältnis ist dann im Vergleich zu den Thornton Konstante oder die theoretische Oxycaloric entspricht, die zwischen-430-480 kJ Mol-1 je nach Zelllinie oder Gewebe von Interesse und ergänzten Kohlenstoff Substrate1, 16. so eine negativere CR Verhältnis zeigt erhöhte Beiträge von anaeroben Wege zu insgesamt Stoffwechselaktivität. Zum Beispiel reicht das CR-Verhältnis für die routinemäßige Muskel Gewebe Atmung ohne die aktive Durchführung von Arbeiten von-448-468 kJ Mol-1 im Bereich der theoretischen Oxycaloric entspricht17,18liegt. Unterdessen Säugetier-Krebszellen kultiviert im Medium, die reich an Glucose anzeigen erweiterte Milchsäuregärung nach Glykolyse und relativ niedrigen mitochondriale Engagement19. Dieser Phänotyp Ergebnisse in CR-Verhältnisse im Bereich der-490-800 kJ Mol-1, zeigen eine erhöhte Beteiligung der anaerobe Wege in den zellulären Stoffwechsel angedeutet durch mehr negative CR Verhältnisse1,7, 16,20.
Kommerzielle und gemeinnützige Zell- und Distributoren derzeit Angebot Zelllinien aus über 150 Arten mit fast 4.000 Zelllinien von Menschen abgeleitet. Immortalisierte Zelllinien sind praktische Werkzeuge für schnell Bewertung der Toxizität von potenziellen Therapeutika, von denen viele direkt oder indirekt mitochondriale Funktionen beeinträchtigen. Mit transformierten Zellen während Drogen-Screening kann der begrenzten Aussagekraft zum Teil wegen der Warburg-Effekt, ein Markenzeichen von vielen Krebsarten sein. Oft Krebs erzeugen ATP aus Substrat-Niveau Phosphorylierung und Redox-Gleichgewicht durch die Produktion von Laktat ohne Eingriff vollständig das Mitochondrium unter aeroben Bedingungen19. Pharmazeutische Entwicklung ist notorisch kostspielig und ineffizient, mit etwa 8 von 9 Verbindungen getestet in klinischen Studien am Menschen nicht Markt Genehmigung21erreicht. Während potenzielle Therapeutika erste Sichtung durch geringe Zytotoxizität in Zelllinien passieren kann, ist es möglich, dass einige dieser Verbindungen Mitotoxic sind. Ohne eine geeignete Methode, um zu erkennen, wie diese Toxine die Energiebilanz im Primärzellen beeinträchtigen können, die nicht der Warburg-Effekt angezeigt werden, ist oft wichtige Informationen über sah, therapeutische Entwicklung in frühen Stadien zu Engpässen.
Calorespirometry ist eine praktische, nicht-invasive Ansatz zur Stoffwechselaktivität in einer Vielzahl von biologischen Proben, einschließlich der Zellen und Geweben zu analysieren. Der Kern des vorliegenden Protokolls ist mit einer Vielzahl von Anwendungen kompatibel. Jedoch wurde eine Komplikation festgestellt. Immortalisierte Zellen sind oft in einem Glukose-freies Medium ergänzt mit Galaktose, den Beitrag der Oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) für die Energieerzeugung zu erhöhen, um die Zellen, die potenzielle Mitotoxins22sensibilisieren kultiviert, 23. Diese metabolischen Umprogrammierung erscheint Analyse zu verdecken, wenn Proben in der Edelstahl-Ampullen verwendet durch die Kalorimeter15platziert werden. Zellen in einem Glukose-Medium kultiviert weiterhin in hoher Stoffwechselaktivität für mehrere Stunden zu engagieren. Unterdessen verringern Zellen in Galaktose Medium kultiviert die Wärmeproduktion innerhalb von 30 min von ihrer Platzierung in der Ampulle, Messungen auf frühen experimentellen Zeitpunkte beschränkt. Dieses Verhalten verhindert leider die Möglichkeit, ihre Zellproliferation zu bewerten. Trotz dieser besonderen Einschränkung die meisten Anwendungen sind kompatibel mit Calorespirometric Analyse und metabolische Detailinformationen erhalten Sie durch diesen Ansatz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Ziel des Calorespirometry ist quantitativ bewerten die Beiträge der aeroben und anaeroben Wege zur Stoffwechselaktivität und erhalten eine zusammengesetzte Ansicht der Zellenergie Flussmittel. Dies geschieht durch eine gleichzeitige Messung der Wärmeableitung und Sauerstoff-Fluss, gefolgt durch einen Vergleich der berechneten CR-Verhältnis mit der theoretischen Oxycaloric entspricht. Mehrere wichtige Schritte müssen für reproduzierbare und zuverlässige Daten berücksichtigt werden. Die Aufrechterhaltung einer …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil finanziert von der National Science Foundation Grant CHE 160944, Mary E. Konkle und Michael A. Menze.
Materials
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum – Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
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