Genoom-brede Surveillance van transcriptie fouten in eukaryote organismen
Summary
Dit protocol biedt onderzoekers met een nieuw instrument voor het controleren van de betrouwbaarheid van transcriptie in meerdere modelorganismen.
Abstract
Nauwkeurige transcriptie is vereist voor de trouwe uitdrukking van genetische informatie. Verrassend genoeg echter is weinig bekend over de mechanismen waarmee de betrouwbaarheid van de transcriptie. Om te vullen deze kloof van de wetenschappelijke kennis, we onlangs de cirkel-sequencing assay voor het detecteren van transcriptie fouten in de gehele transcriptome van Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteren Caenorhabditis geoptimaliseerd elegans. Dit protocol zorgt voor onderzoekers met een krachtige nieuwe tool om het landschap van transcriptie fouten in eukaryote cellen toewijzen zodat de mechanismen waarmee de trouw van transcriptie kunnen worden opgehelderd in ongekend detail.
Introduction
Het genoom biedt een nauwkeurige biologische blauwdruk van het leven. Ter uitvoering van deze blauwdruk correct, is het belangrijk dat het genoom te worden overgezet met grote precisie. Transcriptie is echter onwaarschijnlijk dat vrij is van fouten. Bijvoorbeeld, RNA polymerase zijn al lang bekend bij vergissing-geneigd in vitro1,2, en onlangs werd aangetoond dat ze fouten begaan in vivo evenals3,5,6, met name wanneer geconfronteerd met DNA schade7,8,9,10. Samen genomen, deze opmerkingen aangeven dat transcriptie voortdurend in alle levende cellen fouten, suggereren dat ze een potente bron van gemuteerde eiwitten zou kunnen zijn.
Dit proces wordt genoemd transcriptionele mutagenese, verschilt van de klassieke mutagenese op twee manieren. Eerst, in tegenstelling tot genetische mutaties, transcriptie fouten invloed op zowel mitotische en post mitotische cellen, aangezien ze niet afhankelijk van DNA-replicatie. Bestuderen van de mechanismen die van invloed zijn de trouw van transcriptie, daarom krijgt waardevol inzicht geven in de belasting van de mutatie van de mitotische zowel post mitotische cellen. Interessant, transcriptie fouten zijn onlangs betrokken bij de bevordering van eiwit aggregatie11,12,13 en hypothetische hebben is om bij te dragen aan beide carcinogenese10 en de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica in bacteriën14.
Ten tweede, in tegenstelling tot genetische mutaties, transcriptie fouten zijn in de natuur van voorbijgaande aard. Hun tijdelijke bestaan vormt een bijzondere uitdaging omdat het maakt transcriptie fouten buitengewoon moeilijk op te sporen. Bijvoorbeeld, terwijl verschillende labs hebben bedacht waardevolle verslaggever testen voor de studie van transcriptionele mutagenese, kunnen deze testen alleen voor het meten van de transcriptie fouten in een beperkt aantal contexten en model organismen4,15. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben vele onderzoekers aan RNA sequencing-technologie (RNA-seq), waarmee theoretisch transcriptie fouten worden geregistreerd in de gehele transcriptome van elke soort gedraaid. Deze studies zijn echter gemakkelijk verward door bibliotheek bouw artefacten, zoals omgekeerde transcriptie fouten, PCR versterking fouten en de feilbare aard van sequencing zelf. Bijvoorbeeld, omgekeerde transcriptases ongeveer één fout begaan elke ~ 20.000 basen, terwijl RNA polymerase (RNAPs) worden verwacht om te maken maar van één fout elke 300.000 honken5,6. Omdat de foutmarge van omgekeerde transcriptie alleen de foutmarge van RNA polymerase binnen cellen dwergen, is het vrijwel onmogelijk om te onderscheiden waar transcriptie fouten van artefacten, veroorzaakt door de voorbereiding van de bibliotheek in traditionele RNA-Seq-gegevens ( Figuur 1a).
U kunt dit probleem oplossen, ontwikkelden we een geoptimaliseerde versie van de cirkel-Sequencing (Cirseq, of C-seq voortaan) bepaling5,16. Deze bepaling kan de gebruiker voor het opsporen van transcriptie fouten en andere zeldzame varianten in RNA gedurende de transcriptome5. De circulaire-sequencing assay draagt deze naam omdat een belangrijke stap in deze test rond RNA circularization draait. Zodra de RNA-doelstellingen zijn circularized, zijn ze omgekeerde overgezet in een rollende cirkel mode, voor de productie van lineaire cDNA moleculen die vele kopieën van dezelfde RNA sjabloon bevatten. Als een fout aanwezig in een van deze sjablonen was, zou deze fout ook aanwezig zijn in elke één herhaling deel uitmaakt van het cDNA molecuul. In tegenstelling, fouten geïntroduceerd door omgekeerde transcriptie, PCR versterking of sequencing neiging om willekeurig ontstaan, en zullen dus aanwezig zijn in slechts één of twee herhalingen. Dus, door het genereren van een consensus volgorde voor elke cDNA molecuul en willekeurige fouten van fouten die in alle herhalingen optreden te onderscheiden, bibliotheek bouw artefacten kunnen effectief worden gescheiden van ware transcriptie fouten (Figuur 1b).
Indien goed gebruikt, de C-seq-bepaling kan worden gebruikt voor het nauwkeurig detecteren het tempo van de base vervangingen, invoegingen en verwijderingen in RNA hele transcriptome van elke soort (bijvoorbeeld Zie Traverse en Ochman17). Bijvoorbeeld, zijn wij gewend de C-seq-assay genoom-brede metingen van de foutmarge van transcriptie in Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans en Drosophila melanogastervoorzien van een enkele basis resolutie5 (niet-gepubliceerde opmerkingen). Oorspronkelijk gebruikt voor het nauwkeurig volgnummer RNA-virus populaties, is deze geoptimaliseerde versie van de C-seq-bepaling gestroomlijnd om te minimaliseren van de barre omstandigheden tijdens de voorbereiding van de bibliotheek die aan de bibliotheek bouw artefacten bijdragen. Bovendien, met behulp van een aantal commercieel beschikbare kits, is de doorvoer van de bepaling sterk verbeterd, evenals de gebruiksvriendelijkheid. Indien goed gebruikt, kan deze test duizenden transcriptie fouten per repliceren, daardoor sterk verbeteren op eerdere studies6nauwkeurig detecteren. Globaal, is deze methode biedt een krachtig instrument om te studeren transcriptionele mutagenese en toestaat de gebruiker toegang krijgt tot nieuwe inzichten in de mechanismen waarmee de trouw van transcriptie in een breed scala van organismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een geoptimaliseerde protocol voor de bereiding van C-seq bibliotheken voor het opsporen van fouten van de transcriptie in Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegansen Drosophila melanogaster. Dit protocol heeft vele voordelen ten opzichte van de bestaande protocollen, evenals alternatieve technieken.
In de afgelopen 15 jaar, zijn talrijke verslaggever systemen ontwikkeld die afhankelijk zijn van luciferase7,</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze publicatie werd mogelijk gemaakt door financiering verlenen T32ES019851 (C. Fritsch), toekennen R01AG054641, en een jonge onderzoeker van AFAR (M. Vermulst).
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
References
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
- Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
- Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
- Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
- Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
- Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
- Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
- Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
- Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
- van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer’s disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
- van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer’s and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
- Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
- Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
- Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
- Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
- Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Kent, W. J. BLAT–the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
- Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
- Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).
