Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos
Summary
Este protocolo fornece aos pesquisadores uma nova ferramenta para monitorar a fidelidade da transcrição em vários organismos modelo.
Abstract
Transcrição exata é necessária para a expressão fiel da informação genética. Surpreendentemente, porém, pouco é conhecido sobre os mecanismos que controlam a fidelidade da transcrição. Para preencher esta lacuna no conhecimento científico, nós aperfeiçoamos recentemente o ensaio de círculo-sequenciamento para detectar erros de transcrição durante o transcriptoma de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastere Caenorhabditis de elegans. Este protocolo irá fornecer aos pesquisadores uma nova ferramenta poderosa para mapear a paisagem de erros de transcrição em células eucarióticas para que os mecanismos que controlam a fidelidade da transcrição podem ser elucidados em detalhes sem precedentes.
Introduction
O genoma fornece um modelo biológico preciso de vida. Para implementar esta planta corretamente, é importante para o genoma para ser transcrito com grande precisão. No entanto, a transcrição é improvável que seja livre de erros. Por exemplo, a ARN-polimerase tem sido conhecido para ser propenso em vitro1,2, e recentemente foi demonstrado que cometem erros na vivo assim3,5,6, particularmente quando confrontado com DNA danos7,8,9,10. Tomados em conjunto, estas observações indicam que os erros de transcrição ocorrem continuamente em todas as células vivas, sugerindo que poderia ser uma potente fonte de proteínas mutantes.
Este processo, denominado transcriptional mutagênese, difere de mutagénese clássica de duas maneiras. Em primeiro lugar, em contraste com as mutações genéticas, erros de transcrição afetam células mitóticas e pós mitóticas, como eles não dependem de replicação do DNA. Estudar os mecanismos que a fidelidade da transcrição de impacto, portanto, proporcionará insights valiosos sobre a carga de mutação das células mitóticas e pós mitóticas. Curiosamente, erros de transcrição recentemente têm sido implicados na promoção da agregação de proteínas11,12,13 e tem sido a hipótese para contribuir para ambos de carcinogênese10 e o desenvolvimento da resistência aos antibióticos em bactérias14.
Em segundo lugar, em contraste com as mutações genéticas, erros de transcrição são transitórios na natureza. Sua existência temporária é particularmente desafiadora porque erros de transcrição torna extremamente difícil de detectar. Por exemplo, enquanto vários laboratórios desenvolveram ensaios repórter valioso para o estudo de mutagénese transcriptional, estes ensaios só são capazes de medir erros de transcrição em um número limitado de contextos e de4,de organismos modelo15. Para superar essas limitações, muitos pesquisadores se voltaram para a tecnologia de sequenciamento de RNA (RNA-seq), que teoricamente permite erros de transcrição que gravassem em todo a transcriptoma de qualquer espécie. No entanto, estes estudos são facilmente confundidos por artefatos de construção de biblioteca, tais como erros de transcrição reversa, erros de amplificação da PCR e a natureza propensa de sequenciamento em si. Por exemplo, reversa transcriptases cometer um erro de aproximadamente todas as bases de ~ 20.000, enquanto ARN-polimerase (RNAPs) é esperado para fazer apenas um erro cada 300.000 bases5,6. Porque a taxa de erro de transcrição reversa sozinha anões a taxa de erro de polymerases do RNA no interior das células, é virtualmente impossível de distinguir os erros de transcrição verdadeira de artefatos causados pela preparação biblioteca em dados de RNA-Seq tradicional ( Figura 1a).
Para resolver este problema, desenvolvemos uma versão otimizada do círculo-sequenciamento (Cirseq, ou C-seq doravante) ensaio5,16. Este ensaio permite ao usuário detectar erros de transcrição e outras variantes raras no ARN em todo o transcriptoma5. O ensaio da circular-sequenciamento leva este nome porque uma etapa chave neste ensaio gira em torno de circularização de RNA. Uma vez que as metas de RNA são circularizou, são reversos transcrito em uma forma de círculo rolante, para produzir moléculas de cDNA linear que contêm várias cópias do mesmo modelo do RNA. Se um erro estava presente em um desses modelos, esse erro também estaria presente em cada repetição única contida dentro da molécula de cDNA. Em contraste, os erros introduzidos por transcrição reversa, amplificação por PCR ou sequenciamento tendem a surgir aleatoriamente e assim estará presentes em apenas uma ou duas repetições. Assim, gerando uma sequência de consenso para cada molécula de cDNA, e distinção entre erros aleatórios de erros que ocorrem em todas as repetições, artefatos de construção de biblioteca podem efetivamente ser separados de erros de transcrição de verdade (Figura 1b).
Se usado corretamente, o ensaio de seq-C pode ser usado para detectar com precisão a taxa de base substituições, inserções e exclusões no RNA ao longo da transcriptoma de qualquer espécie (por exemplo, ver Traverse e Ochman17). Por exemplo, nós usamos o ensaio C-seq para fornecer medidas de todo o genoma da taxa de erro de transcrição em Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans com uma única resolução base5 (inédita observações). Originalmente usado para sequenciar com precisão as populações de vírus de RNA, esta versão otimizada do ensaio C-seq foi racionalizado para minimizar as condições adversas durante a preparação da biblioteca que contribuem para os artefatos de construção de biblioteca. Além disso, usando um número de kits comercialmente disponíveis, a taxa de transferência do ensaio é muito melhorada, além de sua facilidade de utilização. Se usado corretamente, este teste pode detectar com precisão a milhares de erros de transcrição por replicar, melhorando desse modo extremamente em anteriores estudos6. Em geral, este método fornece uma ferramenta poderosa para estudar transcriptional mutagênese e permitirá ao usuário a ganhar novos insights sobre os mecanismos que controlam a fidelidade da transcrição em uma ampla gama de organismos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para a preparação das bibliotecas C-seq para a detecção de erros de transcrição em Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans. Este protocolo tem numerosas vantagens sobre os protocolos existentes, bem como técnicas alternativas.
Nos últimos 15 anos, numerosos repórter foram desenvolvidos sistemas que dependem do luciferase7,8 ou…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta publicação foi viabilizada pelo financiamento do grant T32ES019851 (C. Fritsch), R01AG054641 e um jovem investigador do AFAR concedem (para M. Vermulst).
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
References
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