がんに関連した疲労におけるミトコンドリア機能の役割の評価
Summary
私たちの目標は、がん患者における倦怠に関連付けられているミトコンドリアの機能障害を評価する実用的なプロトコルを開発することでした。この革新的なプロトコルは、臨床使用を含む標準的な瀉血と基本的な検査に最適です。
Abstract
疲労は共通、ほとんどの患者に影響を与える条件を衰弱させます。これまで疲労残る悪い特徴ないの診断を客観的に測定するこの条件の重大度をテストします。ここで疲れのがん患者から採取した PBMCs のミトコンドリアの機能を評価するための最適化手法について述べる.基底のミトコンドリア呼吸、呼吸の余力を記述するエネルギーの表現型を測定することによって PBMC ミトコンドリア機能状態を検討した小型細胞フラックス システムと呼吸阻害剤の連続注入を使用して、ストレスに反応する最寄りのエネルギー経路。新鮮な PBMCs は臨床設定で標準的な瀉血を使用して容易に利用できます。このプロトコルで記述されている全体の分析は、複雑な生化学的手法の関与なし 4 時間未満で完了ことができます。さらに、再現性のあるデータを取得する必要がある正規化手法について述べる。同じ患者および潜在的な治療効果を評価する時のポイント間で比較することができる再現性のあるデータの生成から繰り返しサンプル収集できる簡単な手順と正規化方法を提示します。
Introduction
疲労は、1がん患者の生活の質にマイナスの影響は、普及していると悲惨な状態です。これまで、ガン疲労定義が不十分なまま、患者2で主観的な報告だけに依存しています。したがって、臨床設定3,4で疲労を客観的に特徴付けるため簡単に適応可能な診断検査を識別するために緊急の必要性があります。
疲労5を原因とするミトコンドリアの機能不全を含む複数の基になるメカニズムを提案されています。ミトコンドリアの酸化的リン酸化を介した細胞のエネルギー需要の 95% を提供する発電所器官し、カルシウム シグナル伝達、アポトーシス、免疫シグナル伝達、他は細胞内のシグナル伝達イベント6の規制に重要な役割を果たす.したがって、障害ミトコンドリア生体エネルギーとエネルギー生産の欠陥に貢献するかもしれない疲労。この仮説をサポートするには、以前の研究は、慢性疲労症候群7患者におけるミトコンドリア DNA の変異を観察しています。疲労の病態生理学的起源は、中枢神経系や骨格筋8,9などの末梢組織内であるかどうかは不明のままがない現在を正確に評価する直接法ライブ、respiring 細胞の疲労に関連するミトコンドリアの機能障害。
末梢血単核球 (PBMCs) を使用して、ミトコンドリアの機能を研究するいくつかの利点を提供しています。まず、PBMCs は臨床設定で標準的な瀉血を使用してすぐに利用できる、基本的な実験技術を使用して迅速に分離することができます。第二に、採血は、筋生検等の組織を収集するよりも低侵襲です。したがって、血液サンプルを収集できます同じ患者から繰り返し治療効果の縦断的評価を容易にする時間をかけて。興味深いことに、PBMCs のミトコンドリアの機能は動物モデル10腎ミトコンドリアの状態とよく相関しているように見えた。さらに、免疫細胞のミトコンドリアは異なった病気の条件11,12の下での制度の変更を検出するためのプロキシとして使用されています。循環免疫細胞内のミトコンドリアは、特に免疫機能の変化に敏感と免疫シグナル分子サイトカイン13,14,15などです。たとえば、急性のリウマチ性の炎症性疾患患者から PBMCs が高いベースライン酸素消費量14を示すことが観察されています。対照的に、敗血症16を含む全身の炎症性疾患を持つ患者から分離された PBMCs の酸素消費量が減った。炎症性の条件の下で高い酸化ストレスと炎症17ミトコンドリアの機能不全によって生成されるフリーラジカルを貢献することかもしれないさらに。ミトコンドリア酸化ストレスと同様、エネルギー生産の中心的な役割は、がん患者13で疲労を勉強するためのプロキシとしてミトコンドリアの機能を使用しての潜在的な有用性を示唆しています。
ミトコンドリアの機能を調べる研究活用生化学的手法、ミトコンドリアの膜電位測定、または臨床設定5,に容易に適応できない可能性があります特定の細胞集団の分離14,18。近年、細胞外のフラックスの試金の開発研究者を簡単に許可しているし、正確に呼吸阻害剤19,20の自動注射に対する酸素消費量 (OCR) の変化を調べる,21,22します。 しかし、これらの研究のほとんどは、特定の細胞型の設計されています、高スループット大判を臨床場面に適用できない場合があります。本稿では臨床使用のためのミトコンドリアの機能を検査するための最適化されたプロトコルについて述べる。
Protocol
Representative Results
Discussion
がん患者における倦怠は、正しく定義されていませんまたは1を特徴と衰弱状態です。疲労の診断は全く主観的な報告に依存している、現在の診断基準や主にその競走2理解の欠如のため、この条件のための治療がないです。がん患者における倦怠の提案されたメカニズム、ミトコンドリアの機能障害が最も治療対象の経路の 1 つ。したがって、積極的に開?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、学内研究部門の国立看護学研究所 NIH は、ベテスダ、メリーランド州のによって完全にサポートされます。
Materials
| CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
| Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
| XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
| XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
| 45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
| Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
| L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
| Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |
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