Subzellulären Fraktionierung von frischen und gefrorenen Magen-Darm-Proben
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine einfache zelluläre Fraktionierung für die subzelluläre Trennung der zytoplasmatischen und nukleare Proteine im menschlichen frisch- und Gefrierfleisch intestinalen Biopsien durchführen.
Abstract
Dieses Protokoll soll menschliche Darmgewebe erhalten durch Endoskopie in Kern- und zytoplasmatischen Fächer für die Lokalisierung Analyse spezifischer Proteine oder Proteinkomplexe in verschiedene Gewebe Staaten (z. B. gesunde fraktionieren vs. Krankheit). Diese Methode ist nützlich für die Fraktionierung von beiden frischen und gefrorenen Darm Gewebeproben; Es ist leicht zugänglich für alle Laboratorien und nicht zeitaufwendig.
Introduction
Proteine an nahezu alle biologischen Funktionen innerhalb einer Zelle und Abweichungen in Struktur, Menge oder Lage zu einem pathogenen Szenario führen kann. Fraktionierung Beispielmethoden Gewebe sind ein sinnvoller Ansatz zur Verringerung der Komplexität der Krankheit im Zusammenhang mit Protein-Analysen. Einige Studien Protein Lokalisierung Informationen verwenden oder ein Protein aus einem spezifischen zellulären Fach zu bereichern, so ein Protokoll für reproduzierbare Fraktionierung von intakten Proteinen sinnvoll, bestimmte biologische Fragen zu beantworten. Bestimmung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen und Überwachung ihrer Substruktur Umverteilung oder Wechselwirkungen bei basalen und Erkrankungen werden dazu beitragen, die Krankheit zu identifizieren im Zusammenhang mit funktionalen Unterschiede1,2. Diese Methode soll somit reproduzierbar Darmgewebe Biopsien, frisch und gefroren, in zytoplasmatischen und nukleare subzelluläre Kompartimente fraktionieren.
Intestinale Biopsie Proben werden routinemäßig während der Endoskopie Verfahren3 (Abbildung 1) gewonnen und können effektiv für Protein Quantifizierung oder Immunopräzipitation Studien verwendet werden. Da Gewebeproben von intestinalen epithelialen Proteine enthält, die direkt an der Krankheit Pathogenese4beteiligt sein können, sind intestinale Biopsie Proben eine sehr wertvolle Quelle für die erfolgreiche Identifikation des intestinalen krankheitsspezifische Proteine. Gespeicherten gefrorenen, geduldige Gewebeproben zusammen mit den klinischen Angaben sind nützliche Quellen für Protein-Analyse und eine einfache und reproduzierbare Probenvorbereitung ist ein Schlüsselthema Zelle lag mit einschränkenden Mengen von Informationen eingefroren Gewebe-5.
Es gibt mehrere handelsüblichen Kits für die Trennung von zellulären Brüche, aber diese sind teurer und in der Regel mehr Zeit in Anspruch als das Protokoll hier vorgestellten. Protokolle basierend auf mehreren Schritten Steigung Zentrifugierung und kontinuierliche Farbverläufe haben auch bereits genutzt, für die Fraktionierung von unterschiedlichen zellularen Fächern in verschiedenen Geweben6,7. Die Konsistenz von kontinuierlichen Gradienten ist jedoch oft eine schwierige Aufgabe. Ähnliche Protokolle basierend auf die sequentielle Lyse von Membranen wurden bisher beschrieben, aber sie brauchen in der Regel mehr als zwei Puffer und die Hände auf Zeit ist länger8 .
Wenn Gewebeproben Fraktionierung, denken Sie daran, dass Gewebe Proben anwesende Zell-Zell und Zelle-Matrix Interaktionen, die nicht in kultivierten Zellen vorhanden und wichtig sind, wenn zur Proteingewinnung voran. Die richtige Aufteilung zwischen Zellen und extrazellulären Matrix ohne die Proteinqualität wird ein kritischer Faktor im Darmgewebe Protein isoliert9sein. In diesem Protokoll sind Zell-Zell und Zellmatrix Kontakte zuerst gebrochen, Freigabe der Zellen und damit des Puffers, die einzelnen Zellen zu erreichen. Um Protein-Fach vor Fraktionierung Vermischung zu vermeiden, muss die Aufteilung der Kontakte auftreten, ohne dass die Integrität der Zellen oder der Kernmembran.
Durch die Anreicherung von verschiedenen Proteasen in der Darmschleimhaut10ist es wichtig, den Proteinabbau während der Extraktion zu kontrollieren. Um die potenziellen Proteinabbau zu minimieren, muss mehrere Protease-Inhibitor in die Protein-Extraktion-Puffer enthalten sein. Darüber hinaus Wenn Extrakte für funktionelle Assays verwendet werden sollen, ist es wesentlich, der Denaturierung von Proteinen oder Proteolyse zu vermeiden, da dies einen Verlust von Protein Aktivität11führt. Zu diesem Zweck des Protokolls erfolgt bei 4 ° C und frische Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF) wird hinzugefügt, um die Puffer auf eine Endkonzentration von 0,1 mM nur vor der Anwendung weiter Proteolyse zu hemmen.
Der erste Schritt in Zelle Fraktionierung ist Gewebe Störungen und Zelle Lysis. Wie bereits erwähnt, ist das Ziel zu disaggregieren der Zellen und die Pause, die sie mit minimaler Beschädigung zu öffnen. Darm Gewebeproben homogenisiert werden müssen, und die Zellen lysiert, um maximale Bruch der Zellmembran zu erreichen. In diesem Protokoll verwenden wir einen motorisierte Stößel-Mixer, um das Darmgewebe zu brechen, die innerhalb von Sekunden durch high-Speed Bereich handeln homogenisiert wird. Nach der Homogenisierung sind Gewebezellen in eine Hypotonische Puffer inkubiert, die platzt die Zellmembran aber halten die Zellkerne intakt, gefolgt durch Zugabe von einem nicht Denaturierung Reinigungsmittel (Nonyl Phenoxypolyethoxylethanol) und eine kurze Vortex Kernen zu trennen aus der zytoplasmatischen Bruchteil. Nach dem Entfernen des Zytoplasmas ist die Zellmembran Kerne in einen hypertonen Puffer mit zitternden platzen.
Die hier vorgestellte Methode ist eine geeignete Methode für die subzellulären Fraktionierung von frischen und gefrorenen intestinalen Biopsien, die während der endoskopischen Verfahren und liegen zwischen 2 und 10 mg an Gewicht gewonnen haben. Das Protokoll ist einfach und reproduzierbar und mit grundlegenden Laborgeräte und Reagenzien in weniger als einer Stunde durchgeführt werden konnte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll wird für die Kern- und zytoplasmatischen Fraktionierung von intestinalen Biopsien verwendet. Der gereinigten Proteine sind nicht denaturiert und kann verwendet werden, nicht nur in der western-Blot Analyse wie in Abbildung 2 und 3 , aber auch in Tests erfordern Native gefaltete Proteine wie Immunopräzipitation, elektrophoretische Mobilität Verschiebung Assay (EMSA) dargestellt oder Native Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE).
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Autoren erkennen die Hilfe von Ander Lopez und Miren Telletxea für video aufnehmen und bearbeiten. ACR ist von einer Ikerbasque Gemeinschaft und ein Forschungsprojekt von Asociación de Celiacos Madrid (ACM) finanziert. JRB wird finanziert durch Projekt ISCIII-PI16/00258 und kofinanziert von der Europäischen Union EFRE/ESF “A Way to Europa machen”. IST ein Projekt Forschungsstipendium 2015111068 der baskischen Gesundheitsministerium finanziert. IRG und AJM werden durch predoctoral Gemeinschaft Zuschüsse aus der UPV/EHU und das baskische Department of Education unterstützt.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
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