Fraccionamento subcelular de espécimes Gastrointestinal frescos e congelados
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para executar um fracionamento celular simples para a separação subcelular de proteínas citoplasmáticas e nucleares em humanas frescas e congeladas de biópsias intestinais.
Abstract
O propósito do presente protocolo é para fracionar o tecido intestinal humano obtido por endoscopia em compartimentos nucleares e citoplasmáticos para a análise de localização de proteínas específicas ou complexos de proteínas em Estados diferentes de tecido (ou seja, saudável versus doença). Este método é útil para o fraccionamento de ambas as amostras de tecido intestinal frescos e congelados; é facilmente acessível para todos os laboratórios e não demorado.
Introduction
As proteínas participam de quase todas as funções biológicas, dentro de uma célula e qualquer variação em sua estrutura, quantidade ou localização pode levar a um cenário de patogenicidade. Métodos de fracionamento de amostras de tecido são uma abordagem útil para reduzir a complexidade da doença relacionadas com análises de proteína. Alguns estudos usam informações de localização de proteínas ou enriquecem uma proteína de um compartimento celular específico, por um protocolo para reprodutível fraccionamento das proteínas intactas, é útil para responder a certas perguntas biológicas. Determinar a Localização subcellular das proteínas e monitorando sua redistribuição compartimental ou interações no basal e condições de doença ajudará a identificar a doença relacionadas com diferenças funcionais1,2. Assim, este método visa reproducibly fractionate biópsias do tecido intestinal, frescas e congeladas, em compartimentos subcellular citoplasmáticos e nucleares.
Amostras de biópsia intestinal são rotineiramente obtidas durante os procedimentos de endoscopia3 (Figura 1) e podem ser efetivamente usadas para quantificação de proteína ou estudos de imunoprecipitação. Desde que as amostras de tecido da intestinal epiteliais conterá proteínas que podem estar diretamente envolvidas na patogênese doença4, amostras de biópsia intestinal são uma fonte muito valiosa para a identificação de sucesso de específica da doença intestinal proteínas. Amostras de tecido congelado, paciente armazenado juntamente com as informações clínicas são recursos úteis para análise de proteínas, e uma preparação de amostras simples e reprodutível é uma questão-chave para fornecer informações compartimental célula usando quantidades limitantes de congelados tecido de5.
Existem vários kits disponíveis comercialmente para a separação de frações celulares, mas estes são mais caros e geralmente mais demorado do que o protocolo aqui apresentado. Protocolos com base em várias etapas centrifugação gradiente e gradientes contínuas também têm sido usados anteriormente para o fraccionamento de diversos compartimentos celulares em diferentes tecidos6,7. No entanto, manter a consistência dos gradientes contínuos é muitas vezes uma tarefa difícil. Protocolos semelhantes baseados o lysis sequencial das membranas têm sido descritos anteriormente mas geralmente precisam de mais de dois buffers e nas mãos na hora é mais8 .
Quando as amostras de tecido de fraccionamento, tenha em mente que o tecido amostras presentes célula-célula e célula-matriz interações que são não presentes em culturas de células e importante quando proceder à extração de proteínas. A repartição adequada entre células e matriz extracelular, sem afetar a qualidade da proteína será um fator crítico do tecido intestinal da proteína isolamento9. Neste protocolo, célula-célula e célula-matriz de contatos primeiro são quebrados, liberando as células e permitindo que o buffer alcançar as células individuais. Para evitar a proteína-compartimento de mistura antes de fracionamento, a repartição dos contatos deve ocorrer sem alterar a integridade das células ou as membranas nucleares.
Devido o enriquecimento de várias proteases na mucosa intestinal10, é importante controlar a degradação proteica durante a extração. Para minimizar a potencial degradação proteica, inibidor de protease múltipla deve ser incluído nos buffers de extração de proteínas. Além disso, se extratos vão ser utilizados para os ensaios funcionais, é essencial para evitar a desnaturação das proteínas ou proteólise, pois isto causará uma perda de proteína atividade11. Para este efeito, o protocolo é realizado a 4 ° C e fluoreto de phenylmethylsulfonyl fresco (PMSF) é adicionado aos buffers em uma concentração final de 0,1 mM apenas antes da utilização para inibir ainda mais a proteólise.
O primeiro passo no fracionamento celular é rompimento de tecido e lise celular. Como mencionado anteriormente, o objetivo é desagregar as células e quebra-los abrir com o mínimo de dano. Amostras de tecido intestinal devem ser homogeneizadas, e as células lysed para alcançar a máxima quebra da membrana celular. Neste protocolo, utilizamos um misturador motorizado pilão para quebrar o tecido intestinal que é homogeneizado em poucos segundos por meio de ação de alta velocidade num Vortex. Após a homogeneização, células do tecido são incubadas em um buffer hipotônica que vai estourar a membrana da célula, mas irá manter os núcleos intactos, seguido pela adição de um detergente não-desnaturação (nonilo phenoxypolyethoxylethanol) e um vórtice curto para separar os núcleos da fração citoplasmática. Após a remoção do citoplasma, a membrana do núcleo celular é de ruptura em um buffer hipertônico com agitação.
O método apresentado aqui é um método adequado para o fraccionamento subcelular de frescos e congelados de biópsias intestinais que foram obtidos durante os procedimentos endoscópicos e intervalo entre 2 e 10 mg de peso. O protocolo é fácil e pode ser reproduzido e pode ser realizado utilizando equipamentos básicos de laboratório e reagentes em menos de uma hora.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui é usado para o fraccionamento nuclear e citoplasmático de biópsias intestinais. As proteínas purificadas não são desnaturadas e pode ser usadas não apenas na análise ocidental do borrão como mostrado na Figura 2 e 3 , mas também em ensaios que exigem nativo-dobrado proteínas tais como imunoprecipitação, ensaio de turno de mobilidade electrophoretic (EMSA) ou eletroforese em gel de poliacrilamida nativo (página).
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem a assistência de Ander Lopez e Miren Telletxea para gravação e edição de vídeo. ACR é financiado por uma bolsa de Ikerbasque e um projeto de pesquisa do Asociación de Celiacos de Madrid (ACM). Orc é financiado pelo projeto ISCIII-PI16/00258 e co-financiado pela União Europeia FEDER/FSE “Uma maneira de tornar a Europa”. É é financiado por uma concessão do projeto de pesquisa 2015111068 do departamento de saúde Basco. IRG e AJM são suportados pelo companheirismo predoctoral subvenções provenientes da UPV/EHU e o departamento de educação de Basco, respectivamente.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
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