신선 하 고 냉동 위장 표본에서 subcellular 분류

Summary

여기, 우리는 인간의 신선 하 고 냉동 장 biopsies에 세포질 및 핵 단백질의 subcellular 분리에 대 한 간단한 세포 분별 법을 수행 하는 프로토콜을 제시.

Abstract

이 프로토콜의 목적은 인간의 창 자 조직 특정 단백질 또는 다른 조직 (즉, 건강 한 상태에서 단백질 복합물의 지역화 분석에 대 한 핵 및 세포질 구획에 내 시경으로 얻은 충분치 대 질병)입니다. 이 메서드는 모두 신선 하 고 냉동 장 조직 샘플;의 분류 그것은 모든 실험실에 대 한 편리 하 고 시간이 소요입니다.

Introduction

단백질 세포 내의 거의 모든 생물 학적 기능에 참여 하 고 그들의 구조, 수량 또는 위치에 달라진 병원 성 시나리오를 발생할 수 있습니다. 조직 샘플 분류 메서드는 질병의 복잡성을 줄이기 위해 유용한 접근 관련 단백질 분석. 일부 연구 단백질 지역화 정보를 사용 하거나 특정 세포질 격실에서 단백질을 풍부 하 게 그대로 단백질의 재현 분별에 대 한 프로토콜은 특정 생물 학적 질문에 대답 하는 데 유용 합니다. 단백질의 subcellular 지 방화를 결정 하 고 그들의 compartmental 재배포 또는 기저에 상호 작용을 모니터링 질병 상태 질병을 식별 하는 데 도움이 됩니다 관련 기능 차이^1,2. 따라서,이 방법은 reproducibly 장 조직 생 검, 두 신선 하 고 냉동, 세포질 및 핵 subcellular 구획으로 충분치를 목표로 합니다.

장 생 샘플 정기적으로 내 시경 절차³ (그림 1) 동안 얻은 고 단백질 정량화 또는 immunoprecipitation 연구에 효과적으로 사용할 수 있습니다. 이후 조직 샘플에서 장의 상피 질병 병 인⁴에 직접 관련 될 수 있습니다 단백질 포함 됩니다, 장 생 검 견본 장 질병 특정의 성공적인 식별에 대 한 매우 귀중 한 소스는 단백질입니다. 임상 정보와 함께 저장된 냉동, 환자의 조직 샘플 단백질 분석을 위한 유용한 리소스 이며 간단 하 고 재현성 샘플 준비의 제한 금액을 사용 하 여 셀 compartmental 정보를 제공 하는 중요 한 문제는 동결 조직⁵.

세포질 분수의 분리에 대 한 몇 가지 상용 키트 하지만 이들은 더 비싼 그리고 일반적으로 보다 더 많은 시간이 소요 여기에 제시 된 프로토콜. 여러 단계 그라데이션 원심 기반 프로토콜 및 지속적인 기온 변화도 또한 이전에 사용 된 다른 조직^6,7에 다양 한 세포질 구획의 분류에 대 한 합니다. 그러나, 지속적인 기온 변화도의 일관성을 유지 하 종종 어려운 작업입니다. 세포 막의 순차적 용 해에 따라 비슷한 프로토콜 이전 설명 하지만 그들은 일반적으로 두 개 이상의 버퍼가 필요 이며 시간에 손을 더 이상⁸ .

조직 샘플을 위하여 때 명심 그 조직 샘플 존재-셀 및 셀-매트릭스 상호 작용 되는 둘 다 하지 경작된 한 세포에 중요 한 단백질 추출을 진행. 세포와 세포 외 기질 단백질 품질을 영향을 주지 않고 적절 한 고장 장 조직 단백질 격리⁹중요 한 요소 것입니다. 이 프로토콜에서-셀 및 셀-매트릭스 연락처가 먼저, 셀을 공개 하 고 개별 셀에 도달 하는 버퍼를 허용. 단백질 구획 분류 전에 혼합을 방지 하려면 연락처의 붕괴는 셀 이나 핵 막의 무결성을 변경 하지 않고 이루어져야 합니다.

¹⁰장 점 막 다양 한 프로 테아의 농축으로 추출 하는 동안 단백질 저하를 제어 하는 것이 중요입니다. 잠재적인 단백질 저하를 최소화 하기 위해 여러 프로 테아 제 억제 물 단백질 추출 버퍼에 포함 되어야 합니다. 또한, 추출 기능 분석에 사용 될 경우,이 단백질 활동¹¹의 손실이 발생할 것 이다 단백질 또는 베이스의 변성을 피하기 위해 필수적입니다. 이 위해 프로토콜 4 ° C에서 수행 하 고 신선한 phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 그냥 더 베이스를 억제 하기 위해 사용 하기 전에 0.1 m m의 최종 농도에 버퍼에 추가 됩니다.

세포 분별 법의 첫 번째 단계 조직 장애 이며 세포 세포의 용 해. 앞에서 설명 했 듯이, 셀과 휴식 그들 최소 손상으로 열을 세분화 하는 목표가입니다. 장 조직 샘플을 균질 해야 합니다, 그리고 셀 lysed 세포 막의 최대 파손을 달성 하기 위해. 이 프로토콜을 사용 하 여 자동화 한 유 봉 믹서 고속 vortexing 작업에 의하여 초 이내 무 균 장 조직 휴식. 균질, 후 조직 세포는 세포 막 버스트 것 이다 하지만 것입니다 핵 그대로 유지, 비 변성 시키기 세제 (nonyl phenoxypolyethoxylethanol)와 핵을 분리 하는 짧은 소용돌이의 추가 의해 따라 소형 버퍼에서 incubated 세포질 분수. 세포질의 제거 후 세포 핵 막 떨고와 마 버퍼에 버스트입니다.

여기에 제시 된 방법은 내 시경 절차와 범위 2 및 10 mg에 무게 동안 얻은 신선 하 고 냉동 장 biopsies의 subcellular 분별에 대 한 적절 한 방법입니다. 프로토콜은 간단 하 고 재현성 고 기본적인 실험실 장비 및 한 시간에 시 약을 사용 하 여 수행할 수 있습니다.

Protocol

이 연구는 Cruces 대학 병원 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 고 모든 과목 또는 그들의 부모 로부터 동의 가져온 후 분석 수행 했다. 1. 생 컬렉션 참고: 환자의 원심 십이지 장 생 검 표본 얻을 수 있습니다 일상적인 진단 내 시경 생 검 관리 동안 무게에 2, 10 밀리 그램 사이 범위. Biopsied 조직 상피, 면역과 내 피 세포를 포함 하 여 다른 세포 유형으로 구성 된 …

Representative Results

그림 1 에서는 그대로 villi와 토 굴 구조는 장 생 섹션의 얼룩이 지는 hematoxylin 오신. 이 프로토콜을 사용 하 여 핵과 세포질 분별 법의 대표적인 결과 그림 2 와 3에 나와 있습니다. 신선한 (Fh), 냉동된 (Fz), 그림 2에 표시 된 실험에서 생 검 했다 동시에 분류 ?…

Discussion

여기에 설명 된 프로토콜 장 검의 핵과 세포질 분별 법에 사용 됩니다. 순화 된 단백질 변성 하지 하 고 그림 2 와 3 만 immunoprecipitation, 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA) 같은 네이티브 접힌 단백질을 필요로 하는 분석 실험에 또한 같이 서쪽 오 점 분석에 사용 될 수 있다 또는 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 (페이지)

설명된 방법 삼 투 세?…

Materials

HEPES	Sigma Aldrich	H4034-1kg
KCl	Sigma Aldrich	P9333-1kg
EDTA	Sigma Aldrich	E9884-100G
NaCl	Sigma Aldrich	5588886-1kg
DTT	Sigma Aldrich	10197777001
PMSF	Thermo Scientific	36978
Proteinase and phosphatase inhibitors	Thermo Scientific	A32959
NP-40	Sigma Aldrich	CA-630	Detergent
BCA assay	Thermo Scientific	23227	Protein quantification kit
Disposable plastic pestles	Sigma Aldrich	Z359947-100EA
Dounce homogeneizer	VWR	431-0100
Microcentrifuge	Eppendorf	5415-R
Shacker	IKA	MS3 basic