تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك
Summary
توضح هذه المقالة طرق محددة للحصول على كميات البيوكيميائية من المنظفات solubilized TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك. بروتوكولات مجتمعة توفر أدوات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية التي يمكن تكييفها لتيسير الدراسات الهيكلية والوظيفية لقنوات أيون الثدييات في بيئة تسيطر عليها غشاء.
Abstract
ترانسدوسي قنوات أيون طالبات المحفزات المتعددة بمختلف أنواعها في التغييرات في اللوستيريك؛ والتشكلات دينامية هذه تشكل تحديا لتحديد ولا تزال غير معروفة إلى حد كبير. مع التطورات الحديثة في واحد-الجسيمات cryo-إلكترون ذرف مجهرية (cryo-م) الضوء على السمات الهيكلية لمواقع ربط مؤثر وتفعيل إليه من عدة قنوات أيون، المسرح معداً لتحليل دينامية متعمقة بهم النابضة آليات استخدام النهج الطيفية. التقنيات الطيفية مثل الإلكترون الرنين باراماجنيتيك (EPR) والرنين إلكترون إلكترون مزدوجة (الغزلان) اقتصرت أساسا على دراسة أيون بدائية القنوات التي يمكن تنقيته بكميات كبيرة. الحاجة إلى كميات كبيرة من البروتينات الوظيفية ومستقرة الغشاء أعاق دراسة قنوات أيون الثدييات باستخدام هذه النهج. تقدم الجيش الشعبي الثوري والغزلان العديد من المزايا، بما في ذلك تصميم الهيكل والتغيرات الدينامية لمناطق البروتين المتنقلة، أن كان ذلك بدقة منخفضة، التي قد يكون من الصعب الحصول على البلورات بالأشعة السينية أو البرد-م، ورصد النابضة عكسها مرحلة انتقالية (أي، مغلقة ومفتوحة، توعية، والمتفجرات). هنا، يمكننا توفير بروتوكولات للحصول على ملليغرام من مستقبلات عابر الوظيفية solubilized المنظفات الموجبة قناة الفصيلية الخامس العضو المحتمل 1 (TRPV1) التي يمكن أن يكون المسمى للتحليل الطيفي الجيش الشعبي الثوري والغزلان.
Introduction
مع التطورات الحديثة في البرد الجسيمات أحادية الإلكترون مجهرية (cryo-م)، تم الحصول على هياكل قناة أيون الثدييات بمعدل غير عادي. وخاصة الدراسات الهيكلية لطالبات أيون قنوات، مثل فانيلويد المحتملة مستقبلات عابر 1 (TRPV1)، قد وفرت كذلك التفاهم على تفعيل آليات1،2،3، 4 , 5-المعلومات الحيوية حول قنوات أيون جزءا لا يتجزأ من بيئة غشاء غير المطلوبة لفهم آليات النابضة والمخدرات-ملزمة بها طالبات.
قدمت الإلكترون الرنين باراماجنيتيك (EPR) والكترون إلكترون مزدوجة الرنين (الغزلان) سبيكتروسكوبيس بعض النماذج آليا إلى نهائي آخر لايون قنوات6،7،،من89 , 10 , 11 , 12 , 13-هذه النهج اقتصرت أساسا على دراسة بدائية وأيون أرتشيال القنوات التي تسفر عن كمية كبيرة من المنظفات تنقية البروتينات عند أوفيريكسبريسيد في البكتيريا. مع تطور إنتاج البروتينات الغشاء حقيقية النواة في خلايا الثدييات للتوصيف الوظيفي والهيكلي14،،من1516والحشرات، من الممكن الآن الحصول على الكيمياء الحيوية كميات من المنظفات تنقية البروتينات للدراسات الطيفية.
تنشأ إشارات الجيش الشعبي الثوري والغزلان من تسمية باراماجنيتيكسبين (SL) (أي، ميثانيثيوسولفوناتي) يعلق على بقايا واحد-سيستين في البروتين. زيادة ونقصان-التسميات التقرير ثلاثة أنواع من المعلومات الهيكلية: الحركة، ووصول، والمسافات. تسمح هذه المعلومات في تحديد ما إذا كانت بقايا مدفونة داخل البروتين، أو يتعرضون للغشاء أو البيئة المائية في الاشتقاق والدول المتجهة يجند13،17،،من1819. في سياق بنية عالية الدقة (عند توفرها)، توفر بيانات الجيش الشعبي الثوري والغزلان مجموعة من القيود لاشتقاق نماذج ديناميكية في بيئتها الأصلية بينما رصد انتقال النابضة عكسها (أي، مغلقة ومفتوحة، توعية، والمتفجرات). وعلاوة على ذلك، يمكن الحصول على مرونة المناطق التي قد يكون من الصعب تحديد من البلورات بالأشعة السينية أو البرد-م باستخدام مجموعات البيانات البيئية هذه لتعيين الهياكل الثانوية، فضلا عن موقع داخل البروتين20. Cryo-م الهياكل التي تم الحصول عليها في دهن نانوديسكس توفر معلومات قيمة حول النابضة أيون القنوات3،،من2122،،من2324، 25؛ ومع ذلك، يمكن أن توفر النهج الطيفية المعلومات الحيوية من الدول كونفورماشونال (مثلاً، التغيرات الحرارية) التي قد يكون من الصعب تحديد استخدام cryo-م.
العديد من الصعوبات التي يجب التغلب عليها لتنفيذ الجيش الشعبي الثوري والغزلان، بما في ذلك عدم وجود وظيفة البروتين عند إزالة جميع مخلفات سيستين (خصوصا وفيرة في القنوات الثديية)، البروتين منخفضة الغلة، وعدم الاستقرار البروتين خلال تنقية وبعد وضع العلامات تدور ، وتجميع البروتين في المنظفات أو الدهنية. وهنا، لقد قمنا بتصميم بروتوكولات للتغلب على هذه الحواجز الهامة وحصلوا على معلومات الأطياف الغزلان والجيش الثوري الشعبي لمستقبلات حسية الثدييات. والغرض هنا وصف منهجيات للتعبير، وتنقية، وضع العلامات، وإعادة تشكيل فأر سيستين-أقل حد أدنى وظيفية TRPV1 (eTRPV1) بناء على تحليلات spectroscopic. هذه المنهجية تعتبر مناسبة لتلك البروتينات الغشاء أن الحفاظ على وظيفتها وعلى الرغم من إزالة بقايا السيستين أو التي تحتوي على سيستين تشكيل ثنائي كبريتيد-السندات. يمكن تكييف هذه مجموعة من البروتوكولات لتحليل spectroscopic قنوات أيون الثدييات الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
التكنولوجيات الحالية للتعبير وتنقية البروتينات الغشاء الثدييات جعلت من الممكن الحصول على كميات كافية من البروتين للدراسات الطيفية14،15،،من1642. هنا، نحن قد تكيفت هذه التكنولوجيات التعبير عن تنقية وإعادة تشكيل، وإجراء ت…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون جداً للدكتور مشورب H. لتوفير الوصول إلى مطيافات الجيش الشعبي الثوري والغزلان والدكتور ت. روزنباوم لتوفير بلازميد TRPV1 سيستين-أقل طول كامل.
Materials
| QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 210519-5 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fisher Scientific | A416 | |
| Albumin Bovine Serum (BSA) | GoldBio.com | A-420-10 | |
| Amylose resin | NEB | E8021L | |
| Aprotinin | GoldBio.com | A-655-25 | |
| Asolectin from Soybean | Sigma | 11145 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen Life Technologies | 10359016 | |
| Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 | |
| Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) | Drummond Scientific | 3-000-203 G/X | |
| Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) | Sutter Instrument | B150-110-10HP | |
| CaCl2 2H2O | Fisher Scientific | C79 | |
| Carbenicillin (Disodium) | GoldBio.com | C-103-5 | |
| Cellfectin Reagent | Invitrogen Life Technologies | 10362-010 | |
| cellSens | Olympus | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606SK | |
| Collagenase Type 1 | Worthington-Biochem | LS004196 | |
| Critiseal | VWR | 18000-299 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| D-(+)-Maltose Monohydrate | Fisher Scientific | BP684 | |
| DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
| High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Sigma | D0572 | |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 45-000-148 | |
| EGTA | Fisher Scientific | O2783 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F-14201 | |
| GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Science, Inc | 2160250 | |
| GenCatch PCR Cleanup Kit | Epoch Life Science, Inc | 2360050 | |
| Gentamicin Sulfate | Lonza | 17-518Z | |
| Glass capillary (25 µl) | VWR | 53432-761 | |
| Glass Flask 2800 mL | Pyrex USA | 4423-2XL | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229 | |
| HEK293S GnTl- | ATCC | CRL-3022 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) | GoldBio.com | I2481C25 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| KCl | Fisher Chemical | P217 | |
| LB Broth, Miller | Fisher bioReagents | BP1426 | |
| Leupeptin Hemisulfate | GoldBio.com | L-010-5 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Life Technologies | 11668-019 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | BP214 | |
| MgSO4 7H2O | Fisher Scientific | BP213 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Ambion | AM1344 | |
| MOPS | Fisher bioReagents | BP2936 | |
| MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate | Toronto Research Chemicals, Inc | O873900 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-062 | |
| Pepstatin A | GoldBio.com | P-020-5 | |
| Pluronic Acid F-127 (20%) | PromoKine | CA707-59004 | |
| PMSF | GoldBio.com | P4170 | |
| Poly-L-lysine Solution | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sealed capillary | VitroCom | special order | |
| SF-900 II SFM (insect cell medium) | Gibco, Life Technologies | 10902-088 | |
| Sf9 Cells (SFM Adapted) | Invitrogen Life Technologies | 11496-015 | |
| Soybean Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids, Inc | 541602C | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590 | |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 29091596 | |
| TCEP HCl | GoldBio.com | TCEP1 | |
| Tetracyclin Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Tris Base | Fisher BioReagents | BP152 | |
| Tryptone | Difco | 0123-01 | |
| X-gal | GoldBio.com | X4281C | |
| Xenopus oocytes | Nasco | LM00935M | |
| XL1 – Blue Competent Cells | Agilent Technologies, Inc | 200249 | |
| Yeast Extract | Difco | 0127-01-7 | |
| Econo-Pack chromatography column | Bio-Rad | 7321010 | |
| Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels | Bio-Rad | 17000436 | |
| pFastBac1 Expression Vector | Invitrogen Life Technologies | 10360-014 | |
| DH10Bac Competent Cells | Invitrogen Life Technologies | 10361-012 | |
| Critiseal capillary tube sealant | Leica Microsystems | 02-676-20 | |
| ABI Model 3130XL Genetic Analyzers | Applied Biosystems | 4359571 | |
| Transfer pipete | Fishebrand | 13-711-9AM | |
| Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 |
References
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
- Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
- Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
- Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
- Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
- Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
- Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
- Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
- Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
- Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
- Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
- Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
- Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
- Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
- McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochimie. 35, 7692-7704 (1996).
- Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochimie. 40, 3828-3846 (2001).
- Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
- Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
- Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
- Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
- Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
- McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
- Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L., Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
- Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861 (2017).
- Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
- Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
- Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
- Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
- Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
- Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040 (2013).
- Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
- Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
- Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740 (2014).
- Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
- Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
- Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
- Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
- Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
- He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
- Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochimie. 48, 5782-5784 (2009).
