精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成
Summary
この記事では、分光分析用洗剤可溶化 TRPV1 の生化学的な量を取得する具体的な方法について説明します。結合されたプロトコルは、膜制御環境で哺乳類のイオン チャネルの構造と機能の研究を容易にするために合わせることが生化学的な生物物理学的ツールを提供します。
Abstract
ポリモーダル イオン チャネルは、アロステリック変更に異なる性質の複数の刺激を変換します。これらの動的分子構造を決定し、主不明のまま挑戦しています。アゴニスト結合部位の構造的特徴といくつかのイオン チャネルの活性化機構の単一粒子の低温電子顕微鏡 (Cryoem) 放出光の最近の進歩、ステージは、ゲートの動的分析の設定します。分光学的手法を用いたメカニズム。電子常磁性共鳴 (EPR) や電子二重共鳴 (鹿) などの分光学的手法は、大量に精製することができます原イオン チャネルの研究に主に制限されています。機能的で安定した膜タンパク質の大量のための要件は、これらのアプローチを使用して哺乳類のイオン チャネルの研究を妨げています。EPR と鹿は、x 線結晶構造解析または Cryoem によって入手が困難なこと、低解像度でとはいえ構造の決定とモバイル蛋白質領域の動的変更を含むとリバーシブルのゲートの監視、多くの利点を提供します。移行 (すなわち、クローズド、オープン、増感と鈍感)。ここでは、ミリグラムの機能洗剤可溶化過渡受容体潜在的な陽イオン チャネル亜科 V メンバー 1 (TRPV1) EPR と鹿分光のラベルすることができますを取得するためプロトコルを提供します。
Introduction
単一粒子の低温電子顕微鏡 (Cryoem) の最近の進歩と哺乳類のイオン チャネルの構造は異常な率で得られています。特に、一過性受容体電位バニロイド 1 (TRPV1) などのポリモーダル イオン チャネルの構造研究を提供しているさらにその活性化機構1,2,3,の理解4,5します。 ただし、膜環境に埋め込まれたイオン チャネルに関する動的な情報はポリモーダル ゲーティングおよび薬剤結合メカニズムを理解する必要です。
電子常磁性共鳴 (EPR) と電子二重共鳴 (鹿) 分光、イオン チャンネル6,7,8,9の最も決定的な機構モデルのいくつかを提供しています。,10,11,12,13。 これらのアプローチは、原核生物の試験に主に制限されていると 3p293光イオン チャネルを細菌の高い洗剤浄化された蛋白質の多量を得られます。昆虫および哺乳類細胞の構造と機能14,15,16の真核生物の膜蛋白質の生産の発展に伴い、それは生化学的を得ることは今分光学的研究のための洗剤浄化された蛋白質の量。
EPR と鹿の信号は、タンパク質の単一システイン残基に付属する paramagneticspin ラベル (SL) (すなわちmethanethiosulfonate) から発生します。スピン ラベル 3 種類の構造情報をレポート: モーション、アクセシビリティ、および距離。この情報は、残基蛋白質の内で埋められるまたは膜または apo と配位子束縛状態13,17,18,19内の水環境にさらされているかどうかを判断できます。(すなわち、クローズド、オープン、リバーシブルのゲート遷移を監視しながら各自のネイティブ環境での動的モデルの導出のための制約のコレクションを提供する EPR と鹿のデータ (ある場合) の高分解能構造の中で、増感と鈍感)。さらに、x 線の結晶学または Cryoem で決定することは困難かもしれない柔軟な地域は、タンパク質20内の場所と同様、二次構造を割り当てるにはこれらの環境のデータ セットを使用して取得でした。脂質 nanodiscs の低温電子顕微鏡構造提供イオンのゲートに関する貴重な情報チャンネル3,21,22,23,24, 25;ただし、分光学的アプローチは、低温電子顕微鏡を使用して確認することは困難かもしれない構造の州 (例えば、温度変化) から動的な情報を提供できます。
EPR と浄化中とスピン標識後システイン残基 (特に哺乳動物チャンネルの豊富な), 低蛋白質収量タンパク質の不安定性を削除するとき、タンパク質の機能の欠如を含む鹿を実装する多くの困難を克服しなければなりません。、と洗剤やリポソームの蛋白質の集合。ここでは、これらの重要な障壁を克服し、哺乳類の感覚受容器の鹿と EPR スペクトル情報を取得するためのプロトコルを設計しています。ここでの目的は分光学的解析の式、浄化、ラベル付け、および機能最小限システイン レス ラット TRPV1 の再構成 (eTRPV1) を構築するための方法論を記述します。この方法は、それらの膜タンパク質のシステイン残基の除去にもかかわらず彼らの機能を維持することまたはシステイン二硫化物結束の形成を含む適切なです。このプロトコルのコレクションは、他の哺乳類のイオン チャンネルの分光分析の合わせることができます。
Protocol
1. TRPV1 の突然変異誘発 注: 分光分析26最小限 TRPV1 コンストラクトは、フルレングス システイン少ないチャネル TRPV127ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 法 (図 1) を使用してから構築されました。このシステイン レス最小限 TRPV1 コンストラクト (以下 eTRPV1) は残基 110 603 と 627-764 から成っています。eTRPV1 pMO (pcDNA3.1 ベース…
Representative Results
最小限のシステイン レス TRPV1 の構築 (eTRPV1) と単一システインの変異体の機能解析 分光学的研究への第一歩は、エンジニア リングおよび機能、蛋白質の生化学的な量をもたらすシステイン少ないタンパク質構造 (図 2 a) を特徴付けます。eTRPV1 は、Ca2 +イメージングおよび TEVC (?…
Discussion
哺乳類膜蛋白質の表現そして浄化のための現在の技術は分光学的研究14,15,16,42のための蛋白質の十分な量を取得する可能にしました。ここでは、エクスプレス、浄化、再構成、および TRPV1 の分光学的解析を実行するこれらの技術を適応しています。
プロトコルの重要なステ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EPR と鹿のスペクトロ メーターへのアクセスを提供するため博士 h. Mchaourab と博士 t. ローゼンバウム フルレングスのシステイン レス TRPV1 プラスミドを提供するために非常に感謝しております。
Materials
| QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 210519-5 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fisher Scientific | A416 | |
| Albumin Bovine Serum (BSA) | GoldBio.com | A-420-10 | |
| Amylose resin | NEB | E8021L | |
| Aprotinin | GoldBio.com | A-655-25 | |
| Asolectin from Soybean | Sigma | 11145 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen Life Technologies | 10359016 | |
| Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 | |
| Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) | Drummond Scientific | 3-000-203 G/X | |
| Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) | Sutter Instrument | B150-110-10HP | |
| CaCl2 2H2O | Fisher Scientific | C79 | |
| Carbenicillin (Disodium) | GoldBio.com | C-103-5 | |
| Cellfectin Reagent | Invitrogen Life Technologies | 10362-010 | |
| cellSens | Olympus | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606SK | |
| Collagenase Type 1 | Worthington-Biochem | LS004196 | |
| Critiseal | VWR | 18000-299 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| D-(+)-Maltose Monohydrate | Fisher Scientific | BP684 | |
| DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
| High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Sigma | D0572 | |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 45-000-148 | |
| EGTA | Fisher Scientific | O2783 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F-14201 | |
| GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Science, Inc | 2160250 | |
| GenCatch PCR Cleanup Kit | Epoch Life Science, Inc | 2360050 | |
| Gentamicin Sulfate | Lonza | 17-518Z | |
| Glass capillary (25 µl) | VWR | 53432-761 | |
| Glass Flask 2800 mL | Pyrex USA | 4423-2XL | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229 | |
| HEK293S GnTl- | ATCC | CRL-3022 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) | GoldBio.com | I2481C25 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| KCl | Fisher Chemical | P217 | |
| LB Broth, Miller | Fisher bioReagents | BP1426 | |
| Leupeptin Hemisulfate | GoldBio.com | L-010-5 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Life Technologies | 11668-019 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | BP214 | |
| MgSO4 7H2O | Fisher Scientific | BP213 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Ambion | AM1344 | |
| MOPS | Fisher bioReagents | BP2936 | |
| MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate | Toronto Research Chemicals, Inc | O873900 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-062 | |
| Pepstatin A | GoldBio.com | P-020-5 | |
| Pluronic Acid F-127 (20%) | PromoKine | CA707-59004 | |
| PMSF | GoldBio.com | P4170 | |
| Poly-L-lysine Solution | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sealed capillary | VitroCom | special order | |
| SF-900 II SFM (insect cell medium) | Gibco, Life Technologies | 10902-088 | |
| Sf9 Cells (SFM Adapted) | Invitrogen Life Technologies | 11496-015 | |
| Soybean Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids, Inc | 541602C | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590 | |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 29091596 | |
| TCEP HCl | GoldBio.com | TCEP1 | |
| Tetracyclin Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Tris Base | Fisher BioReagents | BP152 | |
| Tryptone | Difco | 0123-01 | |
| X-gal | GoldBio.com | X4281C | |
| Xenopus oocytes | Nasco | LM00935M | |
| XL1 – Blue Competent Cells | Agilent Technologies, Inc | 200249 | |
| Yeast Extract | Difco | 0127-01-7 | |
| Econo-Pack chromatography column | Bio-Rad | 7321010 | |
| Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels | Bio-Rad | 17000436 | |
| pFastBac1 Expression Vector | Invitrogen Life Technologies | 10360-014 | |
| DH10Bac Competent Cells | Invitrogen Life Technologies | 10361-012 | |
| Critiseal capillary tube sealant | Leica Microsystems | 02-676-20 | |
| ABI Model 3130XL Genetic Analyzers | Applied Biosystems | 4359571 | |
| Transfer pipete | Fishebrand | 13-711-9AM | |
| Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 |
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Citer Cet Article
Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).