Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche
Summary
Questo articolo descrive metodi specifici per ottenere biochimico quantità di detersivo-solubilizzato TRPV1 per analisi spettroscopica. I protocolli combinati forniscono strumenti biochimici e biofisici che possono essere adattati per facilitare studi strutturali e funzionali per canali ionici dei mammiferi in un ambiente controllato di membrana.
Abstract
Canali ionici polimodali trasducono stimoli multipli di diversa natura allosterico dei cambiamenti; Queste conformazioni dinamiche sono difficili da determinare e rimangono in gran parte sconosciuti. Con gli avanzamenti recenti nella luce spargimento di singola particella cryo-elettrone microscopia (cryo-EM) le caratteristiche strutturali dei siti di legame dell’agonista e il meccanismo di attivazione dei diversi canali ionici, la scena è pronta per un’approfondita analisi dinamica di loro gating meccanismi di utilizzando approcci spettroscopici. Tecniche spettroscopiche quali risonanza paramagnetica elettronica (EPR) e risonanza doppia elettrone-elettrone (cervi) sono state principalmente limitate allo studio dei canali ionici procariote che può essere purificato in grande quantità. Il requisito per grandi quantità di proteine di membrana funzionale e stabile ha ostacolato lo studio dei canali ionici dei mammiferi utilizzando questi approcci. EPR e cervi offrono molti vantaggi, tra cui la determinazione della struttura e cambiamenti dinamici delle regioni della proteina mobile, anche se a bassa risoluzione, che potrebbe essere difficile da ottenere mediante cristallografia a raggi x o cryo-EM, e monitoraggio gating reversibile transizione (cioè, chiuso, aperto, sensibilizzato e desensibilizzati). Qui, forniamo i protocolli per l’ottenimento di milligrammi di funzionale detergente-solubilizzato transitoria del ricevitore potenziale catione canale sottofamiglia V membro 1 (TRPV1) che possono essere etichettati per spettroscopia EPR e cervi.
Introduction
Con gli avanzamenti recenti nella singola particella cRIO-microscopia elettronica (cryo-EM), strutture di canale ionico dei mammiferi sono stati ottenuti ad un ritmo straordinario. In particolare, gli studi strutturali dei canali ionici polimodali, ad esempio il vanilloide potenziale transitorio del ricevitore 1 (TRPV1), hanno fornito ulteriore comprensione della sua attivazione meccanismi1,2,3, 4 , 5. Tuttavia, sono necessari comprendere i loro meccanismi di gating e droga-associazione polimodali informazioni dinamiche su canali ionici incorporati in un ambiente di membrana.
Risonanza paramagnetica elettronica (EPR) e spettroscopie di risonanza (cervi) doppia elettrone-elettrone hanno fornito alcuni dei modelli meccanicistici più definitivi per ioni canali6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. questi approcci sono state principalmente limitati all’esame dei procarioti e dello ione archeal canali che producono una grande quantità di proteine detersivo-purificato quando sovraespresso nei batteri. Con lo sviluppo della produzione di proteine di membrana eucariotiche in insetto e cellule di mammifero per caratterizzazione strutturale e funzionale14,15,16, è ora possibile ottenere biochimici quantità di proteine detersivo-purificato per studi spettroscopici.
I segnali EPR e cervi derivano da un’etichetta di paramagneticspin (SL) (cioè, methanethiosulfonate) legata a un residuo di singolo-cisteina della proteina. Le etichette di spin segnalano tre tipi di informazioni strutturali: movimento, accessibilità e distanze. Queste informazioni consentono di determinare se i residui sono sepolti all’interno della proteina o sono esposti a membrana o ambiente acquoso nella apo e -ligando stati13,17,18,19. Nel contesto di una struttura ad alta risoluzione (quando disponibile), i dati EPR e cervi forniscono un insieme di vincoli per la derivazione di modelli dinamici nel loro ambiente nativo durante il monitoraggio reversibile gating transizione (cioè, chiuso, aperto, sensibilizzato e desensibilizzati). Inoltre, regioni flessibile che potrebbero essere difficile da determinare mediante cristallografia a raggi x o cryo-EM si otteneva utilizzando questi insiemi di dati ambientali per assegnare strutture secondarie così come la posizione all’interno della proteina20. Cryo-EM strutture ottenute in lipidi nanodiscs fornite preziose informazioni circa il gating dello ione canali3,21,22,23,24, 25; Tuttavia, approcci spettroscopici potrebbero fornire informazioni dinamiche da stati conformazionali (ad es., sbalzi termici) che potrebbe essere difficile da determinare utilizzando cryo-EM.
Molte difficoltà devono essere superate per implementare EPR e cervi, compresa la mancanza di funzione della proteina durante la rimozione di tutti i residui di cisteina (particolarmente abbondante nei canali dei mammiferi), proteine di basso rendimento, instabilità proteica durante purificazione e dopo spin labeling e l’aggregazione proteica in detergente o liposomi. Qui, abbiamo progettato protocolli per superare queste barriere critiche e hanno ottenuto informazioni di spettri di cervi ed EPR per un recettore sensoriale dei mammiferi. Lo scopo qui è di descrivere metodologie per l’espressione, purificazione, etichettatura e la ricostituzione di un ratto di cisteina-meno minimo funzionale TRPV1 (eTRPV1) costruire per analisi spettroscopiche. Questa metodologia è adatta per quelle proteine di membrana che mantengono la loro funzione nonostante la rimozione di residui di cisteina o contenenti cisteina che formano legami bisolfurico. Questa raccolta dei protocolli può essere adattata per l’analisi spettroscopica di altri canali ionici dei mammiferi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tecnologie attuali per espressione e purificazione di proteine di membrana dei mammiferi hanno reso possibile ottenere una quantità sufficiente di proteina per gli studi spettroscopici14,15,16,42. Qui, abbiamo adattato queste tecnologie per esprimere, purificare, ricostituire ed eseguire analisi spettroscopiche in TRPV1.
Tra i passaggi critici nel protocollo, qui so…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo molto grati al Dr. H. Mchaourab per fornire l’accesso per gli spettrometri EPR e cervi e Dr. T. Rosenbaum per fornire il plasmide di TRPV1 cisteina-meno full-length.
Materials
| QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 210519-5 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fisher Scientific | A416 | |
| Albumin Bovine Serum (BSA) | GoldBio.com | A-420-10 | |
| Amylose resin | NEB | E8021L | |
| Aprotinin | GoldBio.com | A-655-25 | |
| Asolectin from Soybean | Sigma | 11145 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen Life Technologies | 10359016 | |
| Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 | |
| Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) | Drummond Scientific | 3-000-203 G/X | |
| Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) | Sutter Instrument | B150-110-10HP | |
| CaCl2 2H2O | Fisher Scientific | C79 | |
| Carbenicillin (Disodium) | GoldBio.com | C-103-5 | |
| Cellfectin Reagent | Invitrogen Life Technologies | 10362-010 | |
| cellSens | Olympus | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606SK | |
| Collagenase Type 1 | Worthington-Biochem | LS004196 | |
| Critiseal | VWR | 18000-299 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| D-(+)-Maltose Monohydrate | Fisher Scientific | BP684 | |
| DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
| High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Sigma | D0572 | |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 45-000-148 | |
| EGTA | Fisher Scientific | O2783 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F-14201 | |
| GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Science, Inc | 2160250 | |
| GenCatch PCR Cleanup Kit | Epoch Life Science, Inc | 2360050 | |
| Gentamicin Sulfate | Lonza | 17-518Z | |
| Glass capillary (25 µl) | VWR | 53432-761 | |
| Glass Flask 2800 mL | Pyrex USA | 4423-2XL | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229 | |
| HEK293S GnTl- | ATCC | CRL-3022 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) | GoldBio.com | I2481C25 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| KCl | Fisher Chemical | P217 | |
| LB Broth, Miller | Fisher bioReagents | BP1426 | |
| Leupeptin Hemisulfate | GoldBio.com | L-010-5 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Life Technologies | 11668-019 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | BP214 | |
| MgSO4 7H2O | Fisher Scientific | BP213 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Ambion | AM1344 | |
| MOPS | Fisher bioReagents | BP2936 | |
| MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate | Toronto Research Chemicals, Inc | O873900 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-062 | |
| Pepstatin A | GoldBio.com | P-020-5 | |
| Pluronic Acid F-127 (20%) | PromoKine | CA707-59004 | |
| PMSF | GoldBio.com | P4170 | |
| Poly-L-lysine Solution | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sealed capillary | VitroCom | special order | |
| SF-900 II SFM (insect cell medium) | Gibco, Life Technologies | 10902-088 | |
| Sf9 Cells (SFM Adapted) | Invitrogen Life Technologies | 11496-015 | |
| Soybean Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids, Inc | 541602C | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590 | |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 29091596 | |
| TCEP HCl | GoldBio.com | TCEP1 | |
| Tetracyclin Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Tris Base | Fisher BioReagents | BP152 | |
| Tryptone | Difco | 0123-01 | |
| X-gal | GoldBio.com | X4281C | |
| Xenopus oocytes | Nasco | LM00935M | |
| XL1 – Blue Competent Cells | Agilent Technologies, Inc | 200249 | |
| Yeast Extract | Difco | 0127-01-7 | |
| Econo-Pack chromatography column | Bio-Rad | 7321010 | |
| Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels | Bio-Rad | 17000436 | |
| pFastBac1 Expression Vector | Invitrogen Life Technologies | 10360-014 | |
| DH10Bac Competent Cells | Invitrogen Life Technologies | 10361-012 | |
| Critiseal capillary tube sealant | Leica Microsystems | 02-676-20 | |
| ABI Model 3130XL Genetic Analyzers | Applied Biosystems | 4359571 | |
| Transfer pipete | Fishebrand | 13-711-9AM | |
| Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 |
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