Summary
베타 세포 기능 혈액 포도 당 항상성, 칼슘 유입에 대 한 유전자 인코딩된 기자를 사용 하 여 단일 셀 해상도에서 계산 되는 중요 하다.
Abstract
췌 장 베타 세포는 호르몬 인슐린을 은닉 하 여 증가 혈액 포도 당 농도에 응답. 베타 세포의 기능 장애는 혈당과 심각한, 생명을 위협 하는 결과를 리드. 베타 세포 생리 적 조건 하에서 작동 하는 방법 및 어떤 유전과 환경 요인 그들의 장애를 일으킬 수 있습니다 이해는 당뇨병 환자에 대 한 더 나은 치료 옵션을 발생할 수 있습니다. 베타 세포에 칼슘 수준을 측정 하는 기능 베타 세포 기능, 칼슘 이온 트리거 인슐린 방출의 유입으로의 중요 한 지표 역할을 합니다. 여기는 GCaMP6s, 칼슘의 유전자 인코딩된 센서를 사용 하 여 zebrafish 베타 세포에 포도 당 자극 칼슘 유입 모니터링을 위한 프로토콜에 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 단일 셀 해상도 ex vivo 탑재 독도에서 세포내 칼슘 역학을 모니터링 수 있습니다. 같은 섬 내 베타 세포의 포도 당 응답 수 있습니다 캡처할 수 동시에 다른 포도 당 농도에서 zebrafish 베타 세포 사이 기능이의 존재를 제안. 게다가, 기술은 포도 당 자극에 따라 칼슘 유입의 진동 특성을 보여 높은 시간적, 공간적 해상도를 제공 한다. 우리의 접근 방식을 모델로 제 브라를 사용 하 여 조사 하는 베타 세포의 기능 및 역 기능에 유전과 환경 요인의 기여에 문을 엽니다.
Introduction
우리의 혈액 포도 당 췌 내 분 비의 기능 때문에 큰 부분에서 좁은 범위에 유지 됩니다. 췌 장의 내 분 비 역할은 독도 Langerhans, 호르몬 분 비 세포를 포함 하는 의해 수행 됩니다. 인슐린 은닉 베타-세포는 혈당 탄수화물이 포함 된 식사를 다음 수준을 감소 합니다. 부적당 한 인슐린 베타 세포에서 분 비 당뇨병1, 지속적인된 높은 혈당에 의해 특징에 발생할 수 있습니다. 타입 1과 타입 2 당뇨병, 현재 전세계 400 백만 이상의 사람들이 고생, 병 적 상태와 사망률2이끌어 낸다. 베타 세포 기능 장애에 기여 하는 분자 및 환경 요인, 조사 함으로써 우리가 이해할 것 이다 더 나은 어떻게 타입-2 당뇨병을 시작 하 고 진행. 또한, 인간 줄기 세포 생체 외에서 기능성 베타 세포로 분화 하는 능력 제 1 형 당뇨병에서 세포 대체 요법에 대 한 새로운 베타 세포의 원천을 제공할 수 있습니다. 이 위해, 그것은 베타 세포의 기능 및 유전 모형 유기 체에서 성숙 접시에 기능성 베타 세포를 만들기 위한 필요한 지식을 얻기 위해 공부 하는 것이 중요.
베타 세포 기능 인슐린 응답 포도 당 자극으로 분 비의 총량을 측정 하 여 전체 섬 수준에서 모니터링할 수 있습니다. 이 누적 방법은 셀의 개별 속성을 구분 하지 않고 셀의 단일 그룹으로는 섬을 공부 한다. 그러나, 개별 베타 세포의 포도 당 응답의 분석 다양을 한 베타 세포의 기능 특성에이3의 존재를 밝혔다. 개별 베타 세포의 기능을 평가 하기 위해 인슐린 분 비4이어질 세포내 변화를 모니터링 가능 하다. 인슐린 분 비는 베타 세포로 포도 당의 항목 앞에 있습니다. 베타 세포에 들어가는 포도 당 급속 하 게 ATP를 물질 대사로 변화. 높은 세포내 ATP 농도 ATP-민감한 칼륨 이온 채널 베타 셀 도발은 이어지는 오픈 확률 감소. 도발은 전압에 민감한 칼슘 이온 채널 열리고 세포내 칼슘 증가. 차례 차례로, 칼슘 exocytosis를 순환에 발표 되 고 포도 당 이용5,,67을 홍보 하 여 포도 당 수치를 낮추고 인슐린의 트리거합니다.
몇 가지 전략을 막 잠재적인8, 인슐린 소포 exocytosis9의 직접적인 시각화 및 정량화의 세포내 캘리포니아2 + 의 모니터링을 포함 하 여 베타 세포의 기능을 조사에 적용 포도 당 응답10에 대 한 프록시로 유입. 그 중, 세포내 캘리포니아2 + 의 영상 업 스케일링 같은 섬11,12, 간의 포도 당 응답의 직접 비교를 위해 수 있도록 내 여러 개별 셀에 분석의 이점을 제공 한다 개별 베타-셀입니다. 세포내 캘리포니아2 + 농도 칼슘-민감한 형광 염료13 또는 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)14를 사용 하 여 모니터링할 수 있습니다. 반면 칼슘 표시기 염료 부족 셀 형 특이성, GECIs 특정 발기인에 의해 특정 셀 형식으로 표현할 수 있습니다. 또한, GECIs, GCaMP6, 등의 새로운 세대는 빠른 임시 역학15와 함께 더 나은 신호 대 잡음 비율을 제공 한다. 여기는 단일 셀 해상도에서 베타 세포에서 칼슘을 시각화 하기 위해 특정 GCaMP6s에 있는 GECIs의 새로운 세대의 유틸리티에 설명 합니다. 우리 선택의 우리의 모델로 zebrafish 주 섬에이 메서드를 적용 됩니다. 배아 개발 하는 동안 베타 세포 주 섬에는 등 쪽에서 발생 하 고 복 부 췌 장 새싹16. 주 섬은 쉽게 식별 및 격리 zebrafish 췌 장 내에서 틀에 박힌 해 부 위치에 있습니다. 그들의 유전 제거 혈당17,18에 리드 주 섬에 베타 세포 포도 당 규칙을 위한 필요 하다. 또한,이 베타 세포 초기 zebrafish 개발19동안에 포도 당 응답 되. 이 프로토콜은 포스트 미 발달 단계 형성 보조 독도 영상에 적용할 수 있습니다. 프로토콜 정의 된 포도 당 농도 및 개발의 나중 단계에서 이미지 베타 세포 비보 전, 수 있습니다.
Protocol
동물 주제를 포함 하 여 모든 절차 Landesdirektion 뉴 스타트 인섹 센, 독일 (AZ 24-9168.11-1/2013-14, T12/2016)의 허가 동물 복지 행위에 의해 승인 되었습니다가지고.
1입니다. 준비
참고:이 프로토콜은 이중 유전자 변형 Tg에서 zebrafish 주 섬의 비보 전 영상 (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 제 브라. 이 유전자 변형 라인에서 인슐린 발기인 (ins) 드라이브 두 transgenes의 베타 세포 특정 식: nls-Renilla-mKO2, 단위체 Kusabira 오렌지 2 (mKO2)와 베타 세포의 핵을 표시 형광; 그리고 GCaMP6s15, 세포내 칼슘 수준에 증가에 대 한 응답에서 녹색 형광을 방출 한다. GCaMP6s의 베타 세포 특정 식 세포 유형 주변에 칼슘 변화에서 간섭 없이 베타 세포의 포도 당 응답을 공부 하 고 있습니다.
- 캘리포니아2 +/Mg2 +의 1 mL에 소 fibrinogen의 10mg을 용 해 하 여 신선한 fibrinogen 주식 (10mg/mL) 준비-행 크 스 균형 소금물 (HBSS) 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 들어 있는. Fibrinogen 파우더까지 적극적으로 소용돌이 완전히 녹 인 다. 더 이상 15 분 동안 실내 온도에 솔루션을 계속.
참고: 재고 솔루션 유해를 시작 하 고 점성 된다 경우 2-3 헤 취소 재고에 대 한 실 온에서 보관할 수 있습니다. - 3 겹에 HBSS fibrinogen 주식을 diluting 하 여 fibrinogen 작업 솔루션 (3.3 mg/mL)을 준비 합니다. 예, fibrinogen 재고 fibrinogen 작업 솔루션의 900 µ L를 준비 하는 HBSS의 600 µ L에서 300 µ L를 혼합.
- 10을 용 해 하 여 트 롬 빈 솔루션 (10 U/mL)를 준비 단위 HBSS 또는 인산 염의 1 mL에 트 롬 빈의 버퍼링 식 염 수 (PBS).
참고:이 솔루션 50 µ L 부분에 aliquoted 사전에 준비 하 고 수-20 ° c.에 언 - 물 50 mL에 D-포도 당 1.8 g을 용 해 하 여 200 m m D-포도 당 솔루션을 준비 합니다. 장기 저장을 위한 4 ° C에서 유지.
- 물 50 mL에 KCl의 1.1 g을 용 해 하 여 300 mM KCl 솔루션을 준비 합니다. 장기 저장을 위한 4 ° C에서 유지.
- 장착은 독도 대 한 35 m m 직경 유리 하단 요리를 조달.
- 해 부 및는 섬에의 설치 사용 하 여 형광 램프와 빨간 필터 큐브 스테레오 현미경 (TRITC: 여기: 532-554 nm, 방출: 570-613; 또는 텍사스-레드: 여기: 540-580 nm, 방출: 592-667 nm).
- 이미징 (0.8 없음) X 20는 거꾸로 confocal 현미경 (LSM 780 또는 이와 유사한 Zeiss) 목표 공기와 35 m m 직경 유리 하단 요리 접시 홀더 장착 사용에 베타 세포에서 칼슘의 유입에 대 한.
- Zebrafish는 euthanizing tricaine 메탄 된 (MS222)의 200 mg/L 솔루션 준비.
- Zebrafish 해 부에 대 한 90 mm 페 트리 접시를 조달.
2. 제 브라 주 섬 해 부 및 장착
- MS222에서 머리말 붙인된 외피를 사용 하 여 물고기 안락사 이 위해 부드럽게 낚시 그물을 사용 하 여 어항에서 물고기를 제거 하 고 동물 opercular (아가미) 운동; 표시 될 때까지 MS222 솔루션을 포함 하는 페 트리 접시에 그것을 품 어 일반적으로,이 걸립니다 5 분 전송 물고기 Ca2 +/Mg2 +HBSS 솔루션을 포함 하는 배양 접시에.
-
스테레오 현미경 형광 램프와 빨간 필터 큐브, 췌를 동물의 복 부의 오른쪽을 덮고 피부를 해 부.
- 이 대 한 날카로운 집게를 사용 하 여 항문 지 느 러 미에 입에서 zebrafish의 피부를 잘라. 복 부; 노출 컷된 피부 벗 겨 이 자르는 내부 장기 노출합니다. 베타 세포의 mKO2 식의 빨간 형광을 사용 하 여 시각적인 검사는 현미경으로 독도의 위치를 확인 합니다. 필요한 경우, 그들은 찾기 어려운 섬 표지 수 간의 돌출부를 제거 합니다.
참고: 주 섬은 오른쪽에 일반적으로 복 부의 앞쪽 지역 근처에 위치.
- 이 대 한 날카로운 집게를 사용 하 여 항문 지 느 러 미에 입에서 zebrafish의 피부를 잘라. 복 부; 노출 컷된 피부 벗 겨 이 자르는 내부 장기 노출합니다. 베타 세포의 mKO2 식의 빨간 형광을 사용 하 여 시각적인 검사는 현미경으로 독도의 위치를 확인 합니다. 필요한 경우, 그들은 찾기 어려운 섬 표지 수 간의 돌출부를 제거 합니다.
- 신중 하 게 간, adipocytes 등 주변 조직을 제거 하 여 주 섬 청소. 주의 손상 또는 찌를 섬; 주변 조직의 지운 후 섬 표면에 개별 셀 될 뚜렷한.
- 유리 하단 접시의 중앙에 30 µ L 방울 HBSS 플라스틱 이 드롭 해 부 섬 전송.
- 조심 스럽게 씻어 한번 HBSS와 함께 한 번 30 µ L fibrinogen 작업 솔루션 (3.3 mg/mL)의 작은 섬. 이렇게 하지 않으면 세포 죽음에서 발생 하기 때문에 세척 단계는 섬의 건조 하지 않도록 해야 합니다.
- 천천히 그리고 부드럽게 트 롬 빈 솔루션 (10 U/mL)의 10 µ L를 추가 합니다. 섬 두고 접시 15-20 분 fibrinogen-트 롬 빈 드롭 관찰에 대 한 손길이 닿지 않은 점성 및 약간 불투명 한이 시점에서 될 것입니다.
3. 제 브라 주 독도에서 GCaMP 형광 강도의 전 비보 라이브 영상
- 금형 위에 HBSS의 200 µ L을 추가 하 고 confocal 현미경의 플레이트 홀더에 신중 하 게 접시를 놓습니다. 20 X, 0.8 나 공기 목표를 사용 하 여 confocal 영상에 대 한. 섬을 대물 옵션을 사용 하 여 찾습니다.
- 빨간 형광에 대 한 필터를 사용 하 하는 섬에 초점, 베타 세포에서 핵 mKO2 형광을 볼 수 있습니다. 개별 핵은 명확 하 게 표시 되어야 합니다.
- z 축 따라 섬의 두께 통해 이동 하기 위하여 공초점 현미경의 초점 비행기를 수동으로 변경 하 여 명확한 영상 평면을 찾습니다. 특히 섬 중앙에에서 핵 mKO2 형광의 밝기는 유니폼, 이미징 비행기 이미징, 베타 세포의 충분 한 수 (50-100)를 포함 확인 하십시오.
- "스마트 설정 메뉴"에서 다음 설정을 사용 하 여 GCaMP6s 및 mKO2 형광에 대 한 순차적 인수 설정: GCaMP6s, 여기: 488 nm, 방출: 500-555 nm, false-색상: 그린 (선택 "GFP"); mKO2, 여기: 561 nm (mCherry), 방출: 570-630 nm, false-색상: 레드 (선택 "mCherry").
참고:이 설정을 사용 하 여 빨강 채널 기록할 것 이다 베타 세포 핵의 위치 녹색 채널 GCaMP 형광 강도 기록 하는 동안. - "수집 모드"에서 1024 x 1024 픽셀에서 이미지 해상도 설정, 10와 1에서 평균 속도. 연속 시작 "시계열"에 대 한 옵션을 선택 하 고 프레임 당 약 2 s 수집 시간 500 사이클, "기간"을 설정 하 여 녹음 합니다.
참고: 시간 시리즈의 처음 50 프레임 5 mM 포도 당 농도에서 베타 세포의 활동에 해당합니다. 이것은 초기 응답 이다. 응답 베타 셀 왁 싱 시간 녹색 형광 강도 말기 표시 됩니다. 우리는 몇 가지 (1-5%)는 베타 세포의 5 mM 포도 당에서 진동 관찰. -
이미징 사이클에 잘 감시 해. 처음 50 프레임 후 녹화를 중지 하지 않고 10 m m 주변 솔루션의 포도 당 농도 증가.
- 이미지 수집, perturbing 없이 부드럽게 200mm는 섬 들고 젤 위에 D-포도 당 솔루션의 5 µ L 플라스틱. 10 m m 포도 당에서 150 프레임을 획득 합니다.
참고: 포도 당 농도 증가의 베타 세포 수 증가 GCaMP 형광 진동 녹색 채널에 받고. - 유지 하는 세포의 핵 안정 과정에서. 섬 중 광범위 하 게 떨고 핵 초점 평면에서 이동 하는 경우 (필요한 경우) 샘플 삭제.
- 다음 샘플의 안정성을 보장 하기 위해 fibrinogen-트 롬 빈 금형의 합 수 있도록 충분 한 기간을 기다립니다.
- 이미지 수집, perturbing 없이 부드럽게 200mm는 섬 들고 젤 위에 D-포도 당 솔루션의 5 µ L 플라스틱. 10 m m 포도 당에서 150 프레임을 획득 합니다.
- 200 프레임에서 더 부드럽게 200 m m D-포도 당 솔루션의 10 µ L를 pipetting으로 20 mm 용액의 농도 증가. 20 mM 농도 대 한 150 프레임을 획득 합니다.
- 350 프레임 후 섬 KCl의 30 m m를 사용 하 여 depolarize. 이 위해 20 µ L 300 m m KCl 재고 솔루션을 추가 합니다. 이 단계에서 관찰 GCaMP6s 형광 진동 중지 하 고 고 강도;에 수정 베타 세포 포도 당에 반응 하지 않았다 또한 KCL 추가 시 녹색 형광 강도 증가 표시할 수 있습니다.
4. 개별 베타 세포에 대 한 GCaMP 형광 추적의 정량화
참고: 추적 하 고 개별 베타 세포의 포도 당 수준의 응답 계량, 전체 이미징 동안 GCaMP 형광 강도 수량화 합니다. 정량화는 셀룰러 해상도에서 수행 됩니다. 이 위해 피지20 을 사용 하 여 이미지 (4.1-4.6 단계), 그리고 스프레드시트 소프트웨어 또는 분석 (4.8-4.9 단계)를 수행 하려면 R21 에서 GCaMP 형광의 강도 값을 추출.
- 피지 "LSM 도구 상자"를 사용 하 여 이미지 파일을 엽니다. 이 위해 선택 "플러그인 | LSM 도구 상자 | LSM 도구 상자 표시 ". "LSM 도구 상자", "오픈 LSM"를 클릭 하 고 이미지 파일을 선택 합니다.
참고: "LSM 도구 상자"에서 지원 되지 않는 형식에 대 한 변환 분석을 위한 티파니를 먼저. - 피지에서 관심 영역 (ROI) 도구를 사용 하 여 셀의 응답을 압축을 풉니다. "도구" 아래 "분석" 메뉴에서 "투자 수익 관리자"를 엽니다. 도구 모음에 있는 "다각형 선택 도구"를 사용 하 여 투자 수익을 수동으로 그립니다.
- 베타 세포 핵 되 빨강 채널에 투자 수익을 그립니다. 셀의 세포질의 일부를 포함 하려면 셀의 핵 보다 더 큰 영역을 커버 하는 투자 수익을 선택 합니다. 투자 수익 위치 프레임 사이의 일치 하는지 확인 하 고 필요한 경우 위치를 조정 합니다.
- "[T] 추가" 버튼을 클릭 하 여 선택한 ROIs "ROI 관리자"를 추가 합니다. 선택한 여러 셀에 데이터를 얻기 위해 투자 수익에 여러 ROIs를 추가 합니다.
- 다음, "분석" 메뉴에서 "설정 측정" 선택 합니다. 지정 지역 내에 총 형광 강도의 추출에 대 한 "통합 밀도"를 선택 합니다.
- GCaMP 형광을 포함 하는 녹색 채널을 shift 하 고 "ROI 관리자"에서 "멀티 측정"를 선택 합니다.
참고:이 시간 시리즈를 통하여 셀에 대 한 강도 측정을 제공할 것입니다. - 경우에 투자 수익 위치는 섬의 움직임으로 인해 조정 될 필요가 있다, 수동으로 다른 프레임의 강도 측정을 컴파일하십시오. 복사 하 고 별도 스프레드시트에 값을 붙여 넣습니다.
- "LSM 도구 상자"에서 이미지 프레임의 타임 스탬프를 가져옵니다. 사용 "우표 적용 | T 우표 적용 | 파일 이름 | 덤프 텍스트를 "타임 스탬프를. "다른 이름으로 저장" 옵션을 사용 하 여 타임 스탬프를 저장 하거나 스프레드시트에 복사 합니다.
- 모든 셀에 대 한 강도 값을 컴파일 시 분석 한 셀에 한 번 또는 자동으로 (예를 들어, Excel 수식 또는 R를 사용 하 여)을 수행 합니다.
-
2 단계에서 개별 셀을 분석 합니다.
- 첫 번째 단계에서 기준선 위에 형광 강도 계산 합니다. 이 위해, 처음으로 50 프레임 (5 mM 포도 당)에 대 한 형광 강렬의 평균으로 기준 형광 강도 (F0)을 계산 합니다. 기준선 (0F) 전체 시계열에서 뺍니다 (F-F0).
참고: 몇 가지 세포는 일반적으로 더 높은 농도와 자극을 다음 기저 포도 당에서 분명 GCaMP 진동 표시할 수 있습니다. 이러한 셀만 있는 셀 형광에 한 방울을 보여준 초기 프레임의 평균 강도 취 함으로써 F0 를 추정 가능 하다. - 분석의 두 번째 단계에서 형광 강도 정상화 하 여 최종 GCaMP 형광 강도 얻을.
참고:이 다른 동물에서 독도 간의 차이 제거 수행 됩니다. 개별 독도 포도 당 자극에 따라 형광 방출의 다양 한 레벨을 표시합니다. - 높은 강도 값으로 그것을 분할 하 여 형광 강도 정상화. 이 위해 (F최대 -F0), 피크 강도 계산 하 고 피크 강도 최종 GCaMP 형광 강도를 뺀 초기 계획 값을 나누어 (F-F0) / (F최대 -F0).
- 첫 번째 단계에서 기준선 위에 형광 강도 계산 합니다. 이 위해, 처음으로 50 프레임 (5 mM 포도 당)에 대 한 형광 강렬의 평균으로 기준 형광 강도 (F0)을 계산 합니다. 기준선 (0F) 전체 시계열에서 뺍니다 (F-F0).
- 건강에 해로운 또는 손상 될 수 있습니다 다음 KCl 자극 강도에 변화를 전시 하지 않는 셀을 삭제 합니다.
- R에서 (단계 4.9-4.10) 분석을 수행 하기 위한 사용 R 스크립트 (plotcelltrace. R)이이 원고와 함께 제공.
Representative Results
위에서 설명한 프로토콜을 사용 하는 45 일 후 수정 (dpf) 제 브라에서 한 섬 베타 세포의 포도 당 응답 분석 했다. 이 위해 주 섬 안락사 동물에서 해 부 되었고 유리 하단 접시에 fibrinogen-트 롬 빈 형에 탑재. 섬 5 mM 포도 당을 포함 하는 HBSS에 몰두 했다. 포도 당 농도 단계별 방식으로 10 밀리미터 및 20 밀리미터에 증가 되었다. 베타 세포의 포도 당 농도가 증가 응답 기록 되었다. 마지막으로, 베타 셀 30 m m KCl (그림 1)를 사용 하 여 depolarized 했다. 도발은 KCl을 사용 하 여 건강 한 베타 세포에서 칼슘 항목을 유도 합니다.
피지 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 개별 베타 세포의 GCaMP6s 형광 강도 추출 되 고 정규화 (그림 2). 형광 강도의 추적에서 볼 있듯이, 개별 베타 세포 포도 당 자극, KCl 자극 시 중지 시 GCaMP6s 형광 진동 표시. 기술은 그들의 기능으로 베타 세포의 포도 당-응답 및 창 세포 확인을 합니다.
그림 1: Ex vivo 라이브 이미징 zebrafish 베타 세포에서 GCaMP6s를 사용 하 여 칼슘 유입의. Tg(ins:nls-Renilla-mKO2);에서 주요 섬 Tg(ins:GCaMP6s) zebrafish (45 dpf) fibrinogen-트 롬 빈 형에 탑재 되었고 5 m m (기저) 포도 함께 알을 품을. GCaMP6s 형광 녹색 채널에 존재 하는 동안 베타 세포 빨간 핵 표시와 함께 표시 했다. 섬 10 밀리미터 및 20 밀리미터 D-포도 당, 순차 외피로 구성 된 포도 당 경사로와 자극 그리고 30 m m KCl 화살촉 표시 개별 베타 세포의 활동 분석의 추가 통해 depolarized. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: GCaMP6s 형광 강도-추적 개별 베타 세포에 대 한 정규화. 정규화 된 GCaMP6s 형광 강도-추적 화살표 그림 1에 표시 된 베타 세포에 대 한. X 축에 시간을 (초) 나타냅니다. 맨 바 HBSS 매체에서 포도 당와 KCl의 농도 묘사. Y 시간 시리즈 동안 정규화 된 형광 강도를 나타냅니다. 이 위해, 초기 강도 (F0) 5 mM 포도 당에 부 화 하는 동안 평균 강도 계산 됩니다. 이 전체 시계열 데이터에서 뺍니다 (F-F0). 셀에 의해 표시 된 최대 강도 의해 강도 이상 기준선은 정규화 (F-F0) / (F최대-F0). 정규화 된 추적 셀 30 m m KCl.와 depolarized는 안정 시킨다 포도 당을 베타 세포의 진동 응답을 보여 줍니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기 beta 세포 포도 당 응답 단일 셀 해상도 정량화에 대 한 기술을 설명합니다. 이것은 유전자 인코딩 칼슘 표시기, GCaMP6s를 사용 하 여 세포내 칼슘 농도 모니터링 하 여 이루어집니다. 베타 세포 활동 fibrinogen-트 롬 빈 형에서 섬을 장착 하 여 캡처된 비보 전 이다. 프로토콜의 중요 한 단계는 금형의 안정성 이다. 충분 한 시간 HBSS 용액에 녹이는 것 fibrinogen에 주어질 필요가 있다. 이 없이, 금형 않습니다 이미징 세션 동안 안정성을 제공 하기 위해 충분히 유해 하지. 적어도 1 주 동안 (데이터 표시 되지 않음) fibrinogen-트 롬 빈 형에 탑재 하 고 세포 배양에 있는 섬 가능한 남아 있을 수 있습니다. 낮은 용융 agarose 등 fibrinogen-트 롬 빈 형에 대안 섬22탑재를 활용할 수 있습니다. 또 다른 중요 한 매개 변수는 섬에의 해 부는. 이 단계는 섬 주변 조직 부상 또는 파고는 섬 없이 제거 될 필요가 있다. 숙련 된 해 부 연습 함께 제공 됩니다.
이미징 프로토콜의 한계는 섬에의 한 confocal 평면에 제한 이다. 이렇게 개별 베타 세포 내 칼슘 유입의 역학을 잡으려고 합니다. 섬의 전체 두께 통해 Z 스택 이미징 속도 및 개별 셀에서 진동 신호의 손실 리드. 이 제한 3 차원에서 칼슘 역학을 캡처 수 있도록 같은 회전 디스크 현미경 검사 법, confocal 영상 빠른 수단을 사용 하 여 향상 시킬 수 있습니다. 또 다른 국경 vivo에서 칼슘 이미징12것입니다. Zebrafish 태아의 투명 한 특성 또는 zebrafish 성인23 의 색소 없는 종자를 사용 하 여 생체 내 이미징 미래에 대 한 가능성을 열 수 있습니다.
베타 세포 활동 공간 및 시간 고해상도 이미징 개별 베타 세포 중 기능이 조사를 수 있습니다. 이 방법은 베타 셀 부분 모집단의 존재에 도울 수 있다. 최근, 여러 연구 명목상 동질적인 베타 세포24,,2526부분 모집단의 존재를 나타났습니다. Ex vivo 이미징 포도 당에 대 한 하위-인구의 응답의 성격 유전 기자와 결합할 수 있습니다. 또한 약리 자극 이미징 설치 결합 베타 세포 기능을 향상 시킬 수 있는 화합물의 심사에 대 한 수 있습니다.
요약 하면, 여기에 제시 된 기술 정량화 및 개별 베타 세포의 포도 당 응답의 비교 수 있습니다. 베타 세포 기능, 당뇨병의 발전에 중요 한 매개 변수를 직접 윈도우를 제공합니다.
Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
우리가 원고, 재생 치료 드레스덴 (CRTD) 물고기와 현미경 시설 기술 지원 센터의 회원에 의견에 대 한 Ninov 연구소의 회원을 감사합니다. N.N.는 DFG-CRTD, TU-드레스덴, 독일 연구 재단 (DFG) 및 당뇨병 연구 (DZD)를 위한 독일 센터에 우수 클러스터에서에서 자금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
| Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
| Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
| Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
| Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| 35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
| tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
| FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
| R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
| RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
| plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |
References
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