Бактериальные клетки пространственно высокоорганизованной. Следовать этой организации со временем в медленно растущих клетках Myxococcus xanthus , была разработана установка для флуоресценции клеток изображений с высоким разрешением пространственно-временных течение нескольких поколений. С помощью этого метода, может быть определена динамика пространственно-временных важных белков для хромосома сегрегации и деление клеток.
Флуоресценции клеток изображений бактериальных клеток является ключевым методом анализа пространственной и временной динамики белков и хромосом, лежащие в основе центральной клеточного цикла событий. Однако визуализации этих молекул в медленно растущие бактерии представляет вызов из-за Фотообесцвечивание флуорофоров и Фототоксичность во время захвата изображений. Здесь мы опишем простой протокол для обхода этих ограничений в случае Myxococcus Ксанф (который имеет время поколения 4-6 ч). С этой целью м. xanthus клетки выращивают на толстый блокнот содержащих питательный агар в влажной среде с контролируемой температурой. В этих условиях мы определяем время удвоения отдельных ячеек, следуя роста одиночных клеток. Кроме того ключевым сотовых процессы, такие, как хромосомы сегрегации и деление клеток может быть imaged у Вообразимый флуоресценции клеток клеток, содержащих соответствующие дневно обозначенные маркер белки, например САПИ-рекламы ЯФП, FtsZ-GFP и mCherry-PomX над несколькими Мобильный циклов. Впоследствии приобретенные изображения обрабатываются, чтобы создавать фотомонтажи и/или фильмы.
Бактериальные клетки пространственно высокоорганизованной многие белки, локализация асимметрично в пределах сотовой отсеков1,2,3,4. Эта локализация часто является очень динамичным и изменяется с течением времени в ответ на сигналы клеточного цикла или внешние сигналы. Одинаково бактериальной хромосомы пространственно высоко организованной с отдельных локусах, позиционируется в определенных местах субцеллюлярные до и во время сегрегации процесс5. Этот динамический пространственной организации имеет важное значение для роста, отдела, регуляции клеточного цикла, дифференциация, моторики, трансдукции сигнала, а также хромосомы Организации и сегрегации; Таким образом она затрагивает практически все аспекты бактериальных функции.
Пространственно-временных динамику этих клеточных процессов анализируются в целый ряд различных видов бактерий с кишечной палочки, Сенная палочка, холерный вибриони Caulobacter crescentus , выступающей как важный Модельные организмы. Однако эти четыре вида охватывают лишь небольшой спектр огромного разнообразия бактериальных и, возможно неудивительно учитывая большой филогенетических расстояние между этими видами, клеточных механизмов Организации и поляризации отличаются в этих бактерии. Это вызывает необходимость изучения дополнительных видов бактериальных сможет в конечном итоге извлечь общие принципы, лежащие в основе пространственно-временных динамика бактериальных клеток.
Грамотрицательные Дельта proteobacterium м. xanthus модельный организм в изучении социального поведения и сотрудничество в бактерии6. М. xanthus является строго аэробные и присутствии питательных веществ, он образует колоний, в которых клетки распространились наружу в высоко скоординированных, кишат моды и жертв других микроорганизмов7. В ответ на питательных голода, клетки инициировать программу развития, которая приводит к образованию плодовые тела, который состоит из тысяч клеток и внутри, подвижные клетки палочковидные дифференцировать до сферической диплоидные споры8. Оба типа поведения, т.е., роения и формирования плодовые тела, выполняются только на клетки, которые находятся на твердой поверхности. Кроме того оба питательных условиях клетки участвовать в процессах, которые включают прямые ячеек контактов, включая обмен липопротеинов внешней мембраны, которые могут стимулировать моторику или функционировать как токсины в получателя9,10 , Обмен LPS11, стимуляция моторики, экзополисахаридов на соседние клетки12и межклеточной сигнализации ячейки поверхности якорь сигнализация белка13,14.
Недавно м. xanthus также стал модельный организм для изучения механизмов базового моторики и его регулирование15, деление клеток16,17,18и хромосомы организации19 ,,2021. Критические шаги в м. xanthus клеточного цикла были проанализированы в деталях микроскопии флуоресцирования, используя-снимок изображения или короткий промежуток времени записи на штаммы, перевозящих соответствующих дневно обозначенные протеины16, 17,18,19,20. В идеале многие клетки следует использовать с одной ячейкой резолюции живой клеткой флуоресценции изображений для по крайней мере один полный цикл клетки для получения надежных количественных данных о параметрах клеточного цикла. Однако, это вызов в м. xanthus благодаря его время относительно долго поколения 4-6 ч при стандартных лабораторных условиях и Фотообесцвечивание флуорофоров и Фототоксичность во время захвата изображений.
Здесь мы описываем протокол следовать м. xanthus клетки с одной ячейке резолюции флуоресценции клеток изображений для по крайней мере 24 часа и охватывает несколько циклов клеток. Важно отметить, что во время всего протокола, клетки ведутся на площадку агар и в тесном контакт, позволяя для контакта зависимой деятельности существенно важное значение для социальной жизни стиль м. xanthus. Протокол также позволяет пользователям монитор форму, размер, отделов и флуоресцентных зондов с высоким временным разрешением и с резолюцией одну ячейку и таким образом, позволяет количественная оценка изменчивости в ячейке и корреляции событий клеточного цикла.
Флуоресценции клеток изображений стала мощным инструментом для изучения динамики пространственно-временных бактериальных клеток. Покадровой флуоресцентной микроскопии подвижные и медленно растущих бактерий, таких как м. xanthus, однако, был сложным и была выполнена только на короткое время длительности. Здесь мы представляем easy-to-use и надежный метод для жить Клеточная томография м. xanthus по микроскопии флуоресцирования промежуток времени. Этот метод позволяет пользователю следовать клетки и дневно обозначенные протеины для нескольких раундов клеточного цикла с резолюцией одну ячейку.
Существует несколько предварительных условий, которые влияют на успех клеток изображений медленно растущих м. xanthus клеток включая: 1) твердой поверхности клетки вложения; 2) доступность питательных веществ и кислорода; 3) постоянной влажности и температуры; и 4) оптимизация экспериментальных условий такие воздействия времени и изображения приобретение частоты.
В нашей экспериментальной установки мы используем прокладки толщиной агарозы дополнена питательных веществ. Использование толстых агарозы колодки в отличие от microfluidic приборы следовать одной клетки имеет некоторые основные выгоды, но также некоторые недостатки. Во-первых, агарозы pad не только предоставляет поверхность для м. xanthus клетки вложений и движения, но и достаточного количества питательных веществ для роста по крайней мере 24 часа. Во-вторых оснастки выстрел анализы, обычно используется для изучения внутриклеточной локализации дневно обозначенные белков ранее было сделано на тот же тип агарозы колодки16,17,29. Таким образом данные из оснастки выстрел анализа может быть непосредственно по сравнению с данных, полученных с методом, описанным здесь. В-третьих может быть легко изменена и дополнена антибиотики или другие добавки, такие как CuSO4 агарозы колодки и vanillate, которые широко используются для ген выражение индукции18,30. Наконец потому, что клетки могут microcolonies формы в ходе эксперимента, эта настройка также позволяет, изучая эффект прямых ячеек взаимодействий на определенный параметр анализируется. Этот аспект имеет особенно важное значение в случае из м. xanthus потому что эта бактерия отображает несколько контакт зависимые взаимодействия. Основным недостатком этого метода является, что экспериментальные условия заданы в течение всего эксперимента. Напротив microfluidic приборы, как правило, позволяет, изменяя экспериментальных условий в ходе эксперимента, например добавляя антибиотики31.
Свободное программное обеспечение пакеты (например, MicrobeJ, Oufti) доступны для автоматически анализировать рост одиночных клеток и белков локализации в отдельных ячейках. Однако, эти программы являются лишь хорошо подходит для анализа единичных клеток или небольших групп клеток. Таким образом она остается проблемой для автоматически анализировать данные, полученные для записи 24 h, описанный здесь.
В резюме, мы описали, easy-to-use и воспроизводимые протокол для выполнения визуализации клеток с медленно растущей м. xanthus бактерий. Мы покажем, что простое дополнение питательных агарозы подушечки достаточно для поддержания роста для по крайней мере 24 часа и позволяют для наблюдения и анализа белка локализации и роста с одной ячейке резолюции течение нескольких поколений.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана немецкого Совета исследований (DFG) в рамках Transregio 174 »пространственно-временных динамики бактериальной клетки» и Общество Макса Планка.
DMI6000B with AFC | Leica microsystems | 11888945 | Automated inverted widefield fluorescence microscope with adaptive focus control |
Universal mounting frame | Leica microsystems | 11532338 | Stage holder for different sample sizes |
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 oil PH3 | Leica microsystems | 11506197 | Phase contrast objective |
Orca Flash 4.0 camera | Hamamatsu | 11532952 | 4.0 megapixel sCMOS camera for picture aquisition |
Filter set TXR ET, k | Leica microsystems | 11504170 | Fluorescence filter set, Ex: 560/40 Em: 645/75 |
Filter set L5 ET, k | Leica microsystems | 11504166 | Fluorescence filter set, Ex: 480/40 Em: 527/30 |
Filter set YFP ET, k | Leica microsystems | 11504165 | Fluorescence filter set, Ex: 500/20 Em: 535/30 |
ProScan III | Prior | H117N1, V31XYZEF, PS3J100 | Microscope automation controller with interactive control center |
EL 6000 light source | Leica microsystems | 11504115 | External fluorescence light source |
Incubator BLX Black | Pecon | 11532830 | Black incubation chamber surrounding the microscope |
Tempcontrol 37-2 digital | Leica microsystems | 11521719 | Automated temperature control for incubation chamber |
Gentmycin sulphate | Carl Roth | 0233.4 | Gentamycin |
Oxytetracylin dihydrate | Sigma Aldrich | 201-212-8 | Oxytetracyclin |
Kanamycin sulphate | Carl Roth | T832.3 | Kanamycin |
Filtropur BT25 0.2 bottle top filter | Sarstedt | 831,822,101 | Bottle top filter for sterilization of buffers |
Deckgläser | VWR | 630-1592 | Glass cover slip (60 x 22 mm, thickness: 0.7 mm) |
Seakem LE agarose | Lonza | 50004 | Agarose for microscopy slides |
Leica Metamorph AF | Leica microsystems | 11640901 | Microscope control software and software for picture analysis |
Tetraspeck Microsperes, 0.5 µm | ThermoFisher | T7281 | Fluorescent microspheres |
petri dish | Greiner Bio-one | 688102 | 120 mm x 120 mm x 17 mm squared petri dish for agarose pads |
BD Bacto Casitone | Becton Dickinson | 225930 | Casitone |
Parafilm M | VWR | 291-1213 | Parafilm |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Carl Roth | AE15.2 | Tris |
Magnesium sulphate heptahydrate | Carl Roth | P027.2 | Magnesium sulphate |
Potassium dihydrogen phosphate p.a. | Carl Roth | 3904.1 | Potassium dihydrogen phosphate |
1% CTT medium: 1 % (w/v) BD Bacto™ casitone, 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO4 | Cultivation medium for M.xanthus | ||
TPM buffer: 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO4 | Buffer for preparation of microscopy slides for M.xanthus |