Summary
Lichte productie regelen bioluminescente bacterie via allerlei mechanismen, zoals quorum sensing. Deze nieuwe methode kan de behandeling in situ van bioluminescentie en de correlatie van licht emissie celdichtheid. Een kunstmatige bioluminescente Escherichia coli systeem maakt het mogelijk de karakterisatie van lux operons, Lux eiwitten en hun samenspel.
Abstract
Er is een aanzienlijk aantal bacteriesoorten staat voor het uitstralen van licht. Allemaal delen hetzelfde gen cluster, namelijk de lux -operon. Ondanks deze gelijkenis vertonen deze bacteriën extreme variaties in kenmerken zoals het gedrag van de groei, de intensiteit van licht emissie of regulering van bioluminescentie. De methode die hier gepresenteerd is een nieuw ontwikkelde test die opname van celgroei en bioluminescente licht emissie-intensiteit na verloop van tijd met behulp van een afleesapparaat combineert. De hieruit voortvloeiende toename en lichte emissie kenmerken kunnen worden gekoppeld aan belangrijke kenmerken van de respectieve bacteriële stam, zoals quorum sensing verordening. De teelt van allerlei bioluminescente bacterie vereist een specifiek medium (bijvoorbeeld kunstmatige zee water medium) en temperaturen gedefinieerd. De gemakkelijk te hanteren, niet-bioluminescente standaard-onderzoek bacterie Escherichia coli (E. coli), aan de andere kant, kan worden gekweekt goedkoop in grote hoeveelheden in laboratoriumschaal. Exploitatie van E. coli door de invoering van een plasmide die met de hele lux operon proefomstandigheden kunt vereenvoudigen en bovendien opent vele mogelijkheden voor toekomstige toepassingen. De expressie van alle genen van de lux met behulp van een stam E. coli expressie werd bereikt door de bouw van een plasmide expressie via Gibson klonen en invoeging van vier fragmenten met zeven lux genen en drie rib genen van de lux-rib -operon in een pET28a-vector. E. coli gebaseerd lux genexpressie kan worden geïnduceerd en gecontroleerd via Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) toevoeging resulterend in bioluminescente E. coli cellen. De voordelen van dit systeem zijn gedefinieerd om te voorkomen dat quorum sensing verordening beperkingen en complexe middellange composities samen met niet-standaard groei-omstandigheden, zoals temperaturen. Dit systeem maakt een analyse van lux genen en hun samenspel, door de uitsluiting van het respectieve gen van het operon lux , of zelfs de toevoeging van nieuwe genen, uitwisseling van de genen van de luxAB van een bacteriële stam door een ander, of analyseren van eiwitcomplexen, zoals luxCDE.
Introduction
De uitstoot van licht door levende organismen (bioluminescentie) is een fascinerend proces gevonden in bacteriën, schimmels, insecten, nematoden, vis en inktvis1. Bioluminescente licht emissie blijkt uit een chemiluminescentie reactie waarin chemische energie is (gedeeltelijk) omgezet in licht energie ("cold light"). In bioluminescente bacterie katalyseert de heterodimeric enzym luciferase de monooxygenation van lange keten, alifatische aldehyden, zoals tetradecanal, tegen het overeenkomstige zuren, begeleid door licht emissie met een maximum van 490 nm2, 3.
Figuur 1 : Algemene reactie regeling van bacteriële luciferase. De bacteriële luciferase (LuxAB) de monooxygenation van de lange ketting katalyseert aldehyden (CH3(CH2)nCHO) door gebruik te maken van verminderde flavine mononucleotide (FMNH2) en moleculaire zuurstof (O2), opbrengst van de producten lange ketting van zuren (CH3(CH2)nCOOH), flavine mononucleotide (FMN), water (H2O) en de emissie van licht gecentreerd op 490 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De energie die vrijkomt tijdens deze oxidatie veroorzaakt een geëxciteerde toestand FMN-4a-hydroxide, die fungeert als het oplichtende luciferine4. De eiwitten die betrokken zijn bij bacteriële bioluminescentie, namelijk LuxCDABEG, worden gecodeerd door de lux -operon en zijn zeer behouden over verschillende bacteriestammen2,5. De genen geno - en luxB coderen voor de heterodimeric-luciferase; de luxC, de luxDen luxE van genproducten zijn onderdelen van een vetzuur reductase complex; en luxG codeert voor een flavin reductase6. Een aantal bioluminescente Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) voeren de extra luxF -gen. Het was gemeld dat LuxF is een homodimeric eiwit dat de ongebruikelijke flavin afgeleide 6-(3'-(R)-myristyl bindt)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Extra genen zijn geïdentificeerd die verantwoordelijk voor riboflavine synthese (bijvoorbeeld ribEBH zijn) en bovendien regulatory genen hebben gemeld, die een rol spelen in het quorum sensing regulering van bioluminescentie, vooral voor Vibrio fischeri en Vibrio harveyi6,13. Ondanks de zeer geconserveerde gene orde weergeven bioluminescente bacterie in kenmerken zoals het gedrag van de groei, de intensiteit van licht, of regulering van bioluminescentie2,5,14 hoge variaties .
Verschillende stammen of plasmiden die onderdelen bevatten die zijn gewijzigd of hele lux operons bekend zijn, benutten van bioluminescentie als verslaggever systemen. Verschillende toepassingen, zoals het bepalen van de activiteit van de promotor, toezicht op bacteriële besmettingen in milieu of voedsel monsters, bioluminescentie Resonance Energy Transfer (BRET), in vivo imaging van infecties in eukaryote organismen, waren gevestigde15,16,17pyrosequencing, enzovoort. Interessant is dat gebruikte de drie meest bioluminescente verslaggever systemen zijn afgeleid van de Noord-Amerikaanse firefly (Photinus pyralis), de darmen ziekteverwekkende agens van nematoden (Photorhabdus luminescens) en de zee viooltje (Renilla reniformis). Geen van die systemen heeft een bacteriële oorsprong, maar het gebruik van lux genen en operons van bacteriële oorsprong is het verkrijgen van meer belangstelling voor toegepast onderzoek16. De minder overvloedige toepassingvan bioluminescentie eiwitten uit bacteriële bronnen is voornamelijk te wijten aan lagere stabiliteit en levensduur van bacteriën afgeleid verlichte eiwitten die kunnen worden gerelateerd aan hun mariene habitats. Bioluminescente bacterie van mariene habitats zijn niet standaard lab voorwaarden cultuurgrond. Deze bacteriën vereisen specifieke groeisnelheid media en omstandigheden, zoals kunstmatige zee middellange en lagere groei/incubatie watertemperaturen (bijvoorbeeld 28 ° C).
Om te vereenvoudigen van de vergelijking van lux operon kenmerken of één lux genen van een aantal verschillende bioluminescente bacteriestammen, een methode om te standaardiseren lux operon expressie en analyse is een voorwaarde. Zo ontstond het idee de hele lux-rib -operon te integreren in de standaard-onderzoek bacterie Escherichia coli (E. coli). Voor dit doel, Gibson vergadering bleek te zijn een nuttig instrument om te integreren meerdere lineaire, overlappende fragmenten in één expressie vector zonder de behoefte aan specifieke beperkingsplaatsen. Deze methode is ook geschikt als DNA inserts te groot zijn (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb operon grootte) kan worden versterkt via PCR. Een lux -operon in meerdere overlappende fragmenten kan worden gescheiden, zal vervolgens worden samengevoegd tot één expressie plasmide en ten slotte de volgorde gecontroleerd vergadering product kan direct worden omgezet in een juiste E. coli systeem voor hoge opbrengst eiwit expressie18,19,20. Naast de gemakkelijk te hanteren van E. coli gebaseerd lux genexpressie, bleef een eenvoudige methode combineren opname van celgroei en bioluminescente lichte emissie worden vastgesteld. De hier beschreven methode staat de in situ meting en de correlatie van de celdichtheid en lichte emissie van bioluminescente bacterie.
De analyse van de genen van de lux lux operon orde en regulering van diverse bioluminescente bacterie met aan de ene kant, een kunstmatige bioluminescente E. coli systeem met het hele lux-rib -operon van P. mandapamensis 27561 en aan de andere kant, een nieuw ontwikkelde plaat lezer assay voor het combineren van de opname in situ van de celdichtheid en lichte emissie, helpt bij het krijgen van meer informatie over de verschillende systemen van bacteriële lux . Deze fundamentele karakterisering en vergelijking van luciferases en verwante enzymen kunnen leiden tot alternatieven voor de reeds gevestigde verslaggever systemen met verbeterde stabiliteit en activiteit.
Protocol
1. ontwerp, voorbereiding en expressie van de lux Operon in Escherichia coli
Opmerking: Zie Tabel van materialen voor informatie over commerciële kits gebruikt in deze sectie.
- Voor het overbrengen van de lux -operon in E. coli Kies een standaard huisdier vector met passende beperkingsplaatsen en antibiotica-resistentie gen van belang (b.v., pET28a; NcoI, XhoI, kanamycine).
- Ontwerpen van de fragmenten en overlappende inleidingen voor Gibson vergadering op basis van de opeenvolging van DNA van Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
- Instellen van een standaard PCR reactie met de ontworpen primers en het geïsoleerde genomic DNA van Photobacterium mandapamensis 27561 als sjabloon (Zie Aanvullende materiaal voor primers en voorwaarden).
Opmerking: Isolatie van genomic DNA van de respectieve bacteriële stam verhoogt PCR werkzaamheid. - Het zuiveren van het PCR-product via spin-kolom zuivering.
- Voer een beperkingsspijsvertering van de geïsoleerde pET28a vector met NcoI en XhoI bij 37 ° C voor 45 min.
- Zuiveren van de gelineariseerde vector en de PCR-fragmenten via agarose gel elektroforese en latere spin-kolom zuivering.
- Bepaal de concentratie van de DNA van elk fragment en de gelineariseerde vector en bereken de optimale hoeveelheden voor de vergadering overeenkomstig het protocol van20,21.
Opmerking: Werkzaamheid van vergadering hangt fragment grootte en aantal en moet worden bijgesteld op grond van fabrikant protocol20,21. - Incubeer na alle fragmenten en de buffer in de buis van een PCR te combineren, het mengsel van de vergadering in een PCR machine bij 50 ° C gedurende 1 uur.
- Transformeren van het geassembleerde product van de vector volgens standaard transformatie protocollen voor E. coli bacterieel plasmide omvorming tot een passende E. coli systeem voor hoge opbrengst plasmide replicatie (bijvoorbeeld E. coli TOP10 of XL-1).
- Kies kolonies van de transformatie plaat en streep op nieuwe platen voor DNA isolatie.
- Isoleren plasmide DNA volgens standaardprotocollen.
- Om te controleren of de juiste montage van de plasmide met inbegrip van alle fragmenten, uitvoeren eerst een PCR van de kolonie op basis van standaardprotocollen met behulp van primers specifiek voor ieder geassembleerde fragment.
- Bovendien aan de PCR van de kolonie en de daaropvolgende agarose gelelektroforese, bereiden alle geïsoleerde vergadering vectoren voor DNA rangschikkend om te controleren of de juiste montage en de juiste DNA-sequenties.
- Transformeren de geverifieerde plasmide volgens standaard transformatie protocollen voor E. coli bacterieel plasmide omvorming tot een passende E. coli systeem voor hoge opbrengst eiwitproductie (coli e.g.,E. BL21).
Opmerking: Blijven rechtstreeks met expressie protocol hieronder. Voor langere opslag, is de voorbereiding van een voorraad glycerol aanbevolen.
2. weergave van de gemodificeerde E. coli stammen
- Expressie een overnachting cultuur (ONC) voorbereiden door inoculatie van een passende hoeveelheid LB medium (bijvoorbeeld 100 mL) met de eerder bereid glycerol voorraad van de cellen van de E. coli BL21 wordt verwerkt met de geassembleerde plasmide of rechtstreeks vanuit een transformatie plaat. Voeg 100 µL van kanamycine (50 mg/mL; antibiotica-resistentie gen van pET28a) en na een nacht bebroeden het ONC bij 37 ° C en 120 omw / m in een incubator shaker.
- De belangrijkste expressie cultuur (bijvoorbeeld 800 mL LB voedingsbodem) met het ONC 8 mL beënten en 800 µL van kanamycine (50 mg/mL) toe te voegen.
- Incubeer de belangrijkste cultuur bij 37 ° C en 120 omw / m in een incubator shaker totdat de celdichtheid een OD-600 voor 0.6 bereikt - 0.8 (ongeveer 2,5 h).
- Verlaag de incubatietemperatuur tot 28 ° C.
- Induceren eiwit expressie door IPTG toe te voegen aan een definitieve concentratie van 0,1 mM.
Noot: Empirische tests bleek dat de verlaging van de temperatuur tot 28 ° C gaf de hoogste lichtsterkte. - Observeren cellen totdat ze beginnen schijnt (ongeveer 1 h).
Opmerking: Afhankelijk van het doel van de expressie, de cellen worden gekweekt tot de volgende dag en vervolgens worden geoogst, of de cellen kunnen worden gehouden, zolang ze zijn glanzend (maximaal 48 uur) te schudden. Oogsten van de cellen en de reiniging van alle eiwitten kan gebeuren volgens standaardprocedures.
3. weergave van bioluminescente bacteriestammen
Opmerking: De bacteriestammen bioluminescente vereisen specifieke medium/kunstmatige zee water groeimedium voor groei en lichte productie.
- Kunstmatige zee water medium, samengesteld uit twee afzonderlijk bereid middellange onderdelen voor te bereiden.
Opmerking: De voorbereiding van het kunstmatige zee water medium werd aangepast van het oorspronkelijke protocol22. De volgende bedragen zijn voor opgietvloeistof 1 L of 1 L agar medium.- Voor kunstmatige zee water medium, wegen in de volgende zouten: 28.13 g NaCl, 0.77 g KCl, 1,60 g CaCl2 · 2H2O, 4.80 g MgCl2 · 6H2O, 0.11 g NaHCO3en 3,50 g MgSO4 · 7H2O.
- Voeg 1 liter gedistilleerd water en los van alle onderdelen.
- Voor LB medium, wegen in de volgende ingrediënten: gistextract 10 g, 10 g pepton, en voor een extra 20 gram agar agar platen.
- Voeg 250 mL leidingwater en componenten te ontbinden.
- Autoclaaf, beide bereid media afzonderlijk bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
- Voor agar platen, 250 mL LB voedingsbodem combineren met 750 mL van kunstmatige zee water medium direct na autoclaaf en platen te bereiden.
- Voor opgietvloeistof, 250 mL LB voedingsbodem met 750 mL van kunstmatige zee water medium ofwel direct na autoclaaf of combineren wanneer afgekoeld.
Nota: Het kunstmatige zee water medium kunt krijgen troebel door zout neerslag.
- Strijk de bioluminescente bacteriestammen op kunstmatige zee water middellange agar platen en na een nacht bebroeden bij 24-30 ° C.
Opmerking: Lange tijd opslag van bacteriestammen wordt gewoonlijk bereikt door bevriezing glycerol voorraden van de bacteriecultuur. Stammen moeten altijd worden streaked op agar platen eerst naar het verzekeren van uniforme startende voorwaarden alle stammen, voorafgaand aan gebruik voor vloeibare culturen, als gevolg van een fase van de vertraging in de groei na het ontdooien. - Bereiden een ONC door het enten van 100 mL kunstmatige zee water medium met een één kolonie van de plaat. Na het ONC bij 24-30 ° C en 120 omw / m in een incubator shaker een nacht bebroeden.
- Inoculeer 800 mL van kunstmatige zee water medium met 8 mL ONC.
- Incubeer de bacteriecellen bij 24-30 ° C en 120 omw / m in een incubator shaker.
Opmerking: Het profiel van de lichtintensiteit van bioluminescente bacterie is sterk afhankelijk van temperatuur. Afhankelijk van de regelgevende mechanismen van de lichte productie van de respectieve bacteriële stam, kan lichte emissie starten na ongeveer 1-6 h - Observeer de cultuur van de bacteriële cel totdat ze beginnen schijnt (ongeveer 1-6 h).
Opmerking: Afhankelijk van het doel van de expressie, de cellen worden gekweekt tot de volgende dag en vervolgens worden geoogst, of de cellen kunnen worden gehouden, zolang ze zijn glanzend schudden. Oogsten van de cellen en de reiniging van alle eiwitten kan gebeuren volgens standaardprocedures.
4. in Vivo activiteit Assay voor bioluminescente bacteriestammen en gemodificeerde E. coli stammen
Opmerking: Lange tijd opslag van stammen is normaal acieved door middel van bevriezing glycerol voorraden van de bacteriecultuur. Stammen moeten altijd worden streaked op agar platen eerst naar het verzekeren van uniforme startende voorwaarden alle stammen, voorafgaand aan gebruik voor vloeibare culturen, als gevolg van een fase van de vertraging in de groei na het ontdooien.
- Streep de gewenste bioluminescente bacteriële stam of gemodificeerde E. coli stam op een agarplaat en na een nacht bebroeden bij 28 ° C.
Opmerking: De incubatietemperatuur kan variëren van stam tot stam en moet empirisch worden geëvalueerd. Te kunnen vergelijken bioluminescente bacteriestammen en gemodificeerde hebben E. coli stammen, groei omstandigheden identiek te zijn. - 3 mL medium met de respectieve stam met een één kolonie van een agarplaat beënten en incuberen de cellen bij 28 ° C en 180 rpm in een shaker incubator voor ongeveer 1-2 h.
- Meten van de celdichtheid van een 1:10 verdunning van de vloeibare cultuur bij 650 nm. Bereken de verhouding en het volume van 1 mL cultuur met een OD650 van 0,05.
Opmerking: De volgende plaat lezer bepaling zal het bepalen van de celdichtheid bij 650 nm om storing te voorkomen door de licht emissie van de stammen. - Pipetteer de berekende hoeveelheid cultuur en medium in een 24-well zwart-ommuurde plaat met glazen bodem. Voor de gemodificeerde E. coli stam, voeg 1 µL van kanamycine (antibioticum weerstand van pET28a vector) en 1 µL van IPTG (inductie van genexpressie) naar de monsters. Plaats een deksel op de plaat te vermijden van verdamping tijdens de metingen.
Opmerking: Om te verzekeren dat de vector van de pET28a met het hele lux -operon niet verloren doet gaan door de E. coli -cultuur, kanamycine moet worden toegevoegd aan elk monster van E. coli in de putjes van de plaat en om te verzekeren dat lichte productie van de E. coli cellen kunnen worden gemeten, de genexpressie moet worden geïnduceerd door IPTG. Overspraak en meting om storing te voorkomen, goed platen met glazen bodem en transparante deksel zwart-ommuurde bleek de beste resultaten. Niettemin Overspraak kan worden waargenomen en goed posities moeten zorgvuldig worden gekozen. - Start de meting in een afleesapparaat.
Opmerking: De plaat lezer protocol is gebaseerd op een script speciaal ontwikkeld voor deze assay (Zie Aanvullende materiaal) dat combineert twee metingen, absorptie en bioluminescentie. Gegevenspunten worden verzameld elke 10 min met permanente schudden tussen de metingen en een constante temperatuur van 28 ° C.
Representative Results
De gen-volgorde van het operon lux - luxCDABFEG - is zeer bewaard over verschillende stammen2,5,14. Voor het ontwerp van de plasmide, de opeenvolgingsinformatie werd genomen uit de bioluminescente bacteriële stam Photobacterium mandapamensis 27561 en haar gene orde bleef hetzelfde, en ook noncoding sequenties tussen enkele genen werden beschouwd. Een schematisch overzicht van de toegepaste Gibson klonen strategie is afgebeeld in Figuur 2. Fragmenten van de vier in totaal, luxCDAB, luxF, luxEG, en ribEBH, met 20-40 basenpaar overlappende sequenties werden gegenereerd. DNA sequencing bevestigd na het volgen van alle stappen van de Gibson vergadering20, de juiste montage van de plasmide, met inbegrip van alle fragmenten. De kaart van de vector van de eindmontage product pET28a met de lux-rib -operon is afgebeeld in Figuur 3. Een belangrijk voordeel van deze vector gewijzigde pET28a is het gebruik van gestandaardiseerde E. coli groei omstandigheden en gecontroleerd inductie met IPTG.
Voor het meten van licht uitstoot van bioluminescente bacterie en de respectieve celdichtheid, werd de methode van de lezer op basis van een plaat ontwikkeld. De methode voor de afleesapparaat werd gegenereerd enkele meting scripts voor licht intensiteit en cel dichtheid te combineren. Deze roman script ingeschakeld de meting van OD650 en lichtintensiteit elke 10 min. voor een gebruiker gedefinieerd tijdsbestek, die moet worden aangepast aan de generatietijd van de bacteriën wordt gebruikt voor de respectieve analyse (bijvoorbeeld 10 h). De meting van de extinctie was uitgevoerd bij 650 nm interferentie met de lichte emissie te voorkomen. Als een bewijs van concept en verzeker de gezondheid en het gedrag van de juiste groei van de cellen van E. coli , werden referentiemetingen uitgevoerd. In Figuur 4 de vergelijking van E. coli BL21 cellen, E. coli BL21 cellen met een vector leeg pET28a en E. coli BL21 cellen met de vector van de pET28a met de lux-rib -operon invoegen worden gepresenteerd. Voor de laatste stam, was geen IPTG toegevoegd aan het analyseren van de licht uitstoot als gevolg van de leakiness van de T7 promotor. Alle drie referentiemetingen tonen een sigmoïdale groeicurve met drie groeifases (lag, exponentiële en stationaire fase). Alleen naar de E. coli BL21 cellen met de pET28a-vector met de lux-rib operon invoegen start licht uitstralen, maar in tegenstelling tot de metingen wordt waar expressie wordt geïnduceerd door toevoeging van IPTG en licht uitgestoten na 30 min, de niet-geïnduceerde cellen alleen beginnen te glanzen na ongeveer 5 uur en een veel lagere licht emissie Toon (ca. 4-fold) ten opzichte van de geïnduceerde systeem.
Figuur 5 geeft een vergelijking van de groeikrommes en lichte intensiteiten van de lux -operon in E. coli en de bioluminescente bacteriële stam P. mandapamensis 27561, in LB medium of in kunstmatige zee water medium, uitgedrukt met behulp van de roman, opgericht in situ methode. Om te vergelijken deze bacteriën, werden de metingen uitgevoerd bij een incubatietemperatuur van 28 ° C. Deze temperatuur daalt het groeitempo op jaarbasis van de gemodificeerde E. coli stam in LB medium alsmede kunstmatige zee water medium, maar voor bioluminescente bacteriestammen lagere temperaturen zijn cruciaal. Deze temperatuursafhankelijkheid is zichtbaar in Figuur 5A, zoals P. mandapamensis 27561 een veel hogere celdichtheid dan E. coli toont. Bovendien, terwijl voor E. coli stammen, LB medium kunt generatie voor hogere dichtheden van de cel, voor natuurlijke bioluminescente bacteriestammen, kunstmatige zee water medium is voorkeurs- en essentieel voor bioluminescentie. De opgenomen cel dichtheden correleren met de respectieve licht intensiteit, zoals weergegeven in Figuur 5B. Opmerkelijk, de bioluminescente E. coli cellen bereik soortgelijke licht emissie-maxima in beide LB middellange alsmede kunstmatige zee water medium, hoewel de hoogste intensiteit werden opgenomen op verschillende tijdstippen. In tegenstelling tot deze constatering, P. mandapamensis 27561 is levensvatbaar met sterk verminderde groeicijfers in LB medium, maar de bacteriecellen deed niet licht op alle (Figuur 5B) uitzenden. In kunstmatige zee water medium toont P. mandapamensis 27561 een maximum van licht emissie op ongeveer 1 x 104 punten per seconde, oftewel bijna een factor van 200 lager dan E. coli. Figuur 5 C staat voor relatieve licht eenheden waar de Bioluminescentie is genormaliseerd door de Franse overzeese departementen. Deze resultaten bevestigen dat niet alleen het inbrengen van een plasmide die de lux -operon in E. coli succesvol en functioneel bevat was, maar ook dat dit gewijzigd E. coli stam is een geldig alternatief met nog hogere licht emissie opbrengsten en zonder de beperking van de bacteriële bioluminescentie van marina bacteriën, zoals een complexe zeewater middellange en lagere temperaturen.
Bovendien, werd een lange termijn meten van de genexpressie van E. coli gebaseerd lux-rib meer dan 24u uitgevoerd voor het analyseren van de levensduur van de lichte emissie (Figuur 6). Licht emissie duurde voor 19.5 h, veel langer dan de bacteriestammen (bijvoorbeeld P. mandapamensis 27561) waar een geleidelijke daling werd waargenomen wat resulteert in zeer lage licht emissie na 10 h.
Ter illustratie van de beperkingen van de ontwikkelde assay, Figuur 7 ziet u de meetresultaten van drie bioluminescente bacteriestammen, namelijk Photobacterium mandapamensis S1, Photobacterium mandapamensis TH1 en Vibrio harveyi 14126. Voor de eerste druk (S1), de methode werkt erg goed en geeft een maximale bioluminescentie intensiteit van bijna 2 x 106. Voor de andere twee stammen (TH1 en 14126), de maximale lichtsterkte kan niet worden bepaald omdat de lichtintensiteit gegenereerd door beide de detectiegrens van de gebruikte instrumentele instellingen overschreden. De waarde van de winst voor de ontwikkelde methode (script) voor deze twee stammen gedefinieerd was te hoog ingesteld. Toch kan het begin van de Bioluminescentie activiteit met elkaar worden vergeleken. P. mandapamensis TH1 en P. mandapamensis S1 beginnen schijnt na ongeveer 1 uur en een650 OD-waarde van 0,1 - 0,2, respectievelijk. In tegenstelling, begint V. harveyi 14126 te licht uitstralen na ongeveer 5,5 h bij een650 OD-waarde van 1.0. De waargenomen begin van licht emissie gaat gepaard met een exponentiële toename van de OD evenals bioluminescentie. Het is bekend dat bioluminescentie van V. harveyi 14126 ten grondslag ligt aan het quorum sensing verordening en daarom een specifieke celdichtheid waardoor de activering van het operon lux , die duidelijk waarneembaar in Figuur 7,13. Dit resultaat toont aan dat met deze roman in situ plaat lezer assay is het mogelijk om gemakkelijk vergelijken bioluminescente bacterie en ook ongeveer definiëren een reguleringsmechanisme van deze stammen door te bepalen of een quorum sensing verordening kan zijn waargenomen of niet.
Figuur 8 toont een voorbeeld van een expressie cultuur van E. coli BL21 cellen herbergen van de verzamelde pET28a plasmide met de lux -operon na inductie met IPTG. Na ongeveer één uur na de inductie beginnen de cellen van E. coli schijnt met een blauw-groene kleur. Figuur 8 A toont de E. coli -expressie cultuur in het licht gefotografeerd en Figuur 8B dezelfde cultuur geeft in het donker. Figuur 8 C toont een agarplaat van kunstmatige zee water medium met P. mandapamensis S1 gloeien in het donker in de dezelfde karakteristiek van de blauw-groene kleur voor bacteriële bioluminescentie.
Figuur 2 : Schematische weergave van de toegepaste Gibson klonen strategie. Stap (I): overlappende inleidingen (gekleurde pijlen; ca. 20-40 basenpaar overlappen) zijn ontworpen. Overlappende inleidingen bevatten onthardende reeksen uit de respectieve 5' en 3' regio van één fragment en de respectieve 3' en 5' regio van het aangrenzende segment. Stap (II): De ontworpen fragmenten voor montage worden gegenereerd via standaard PCR reacties. Stap (III): De doel-vector is gelineariseerde door beperkingsspijsvertering (bijvoorbeeld NcoI, XhoI). Stap (IV): De concentraties van DNA van alle fragmenten en de gelineariseerde vector moeten worden bepaald om concentratie geschikt voor Gibson vergadering (volgens protocol van de fabrikant). Stap (V): Alle fragmenten en de gelineariseerde vector met geoptimaliseerde DNA concentraties worden gecombineerd met de Gibson vergadering master mix (T5 exonuclease polymerase van DNA en DNA ligase) en worden geïncubeerd bij 50 ° C gedurende 1 h. stap (VI): het product van de vergadering wordt omgezet volgens standaard protocollen in een passende E. coli stam voor hoog rendement plasmide replicatie (bijvoorbeeld E. coli TOP10 of XL-1). Stap (VII): Om te controleren of de juiste montage van de plasmide, moet DNA sequentiebepaling van het geassembleerde plasmide worden uitgevoerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Kaart van de vector van pET28a met de lux-rib -operon. De lux-rib -operon van P. mandapamensis 27561 wordt ingevoegd in de meerdere klonen site van pET28a in de oorspronkelijke volgorde van gene (luxCDABFEG-ribEBH). Beperkingsplaatsen gebruikt voor het klonen zijn NcoI en XhoI. Fragmenten gebruikt voor Gibson montage van het operon zijn luxCDAB in oranje, luxF in het groen, luxEG in blauw en ribEBH in lavendel; genen binnen een fragment worden weergegeven als een afzonderlijk vak. Noncoding sequenties tussen elk gen van het operon zijn opgenomen in de toegepaste klonen strategie. De grootte van de uiteindelijke plasmide van pET28a met het hele lux-rib -operon is 14.625 basenparen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Vergelijking van groeicurven en lichte intensiteiten van referentie stammen. De OD bij 650 nm en de intensiteit van de bioluminescentie in tellingen per seconde werden gemeten elke 10 minuten meer dan 10 uur te zien bij 28 ° C. Alle metingen zijn gemiddelde waarden van drie biologische replicatieonderzoeken met vier technische replicatieonderzoeken elke. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. E. coli BL21 cellen (grijs vierkantjes), E. coli BL21 cellen met een lege pET28a vector (grijze cirkels) en E. coli BL21 cellen met de vector van de pET28a met de lux-rib operon invoegen (zwarte diamant) werden geanalyseerd om te verzekeren juiste groei gedrag van onze cellen van E. coli . Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Vergelijking van de groeikrommes en lichte intensiteiten van het operon lux uitgedrukt in E. coli (pleinen) en P. mandapamensis 27561 (cirkels) in LB medium (open symbolen) of kunstmatige zee water medium (gevulde symbolen). Alle metingen zijn gemiddelde waarden van drie biologische replicatieonderzoeken met vier technische replicatieonderzoeken elke. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. Alle experimenten werden uitgevoerd bij een incubatietemperatuur van 28 ° C. (A) optische dichtheid (OD) metingen bij 650 nm werden uitgevoerd om de 10 min voor 10 h. E. coli lux operon expressie (linkerdeelvenster) is ten opzichte van P. mandapamensis 27561 (rechtervenster) in LB middellange en kunstmatige zee water medium. Cel dichtheden worden bepaald bij 650 nm bioluminescentie-interferentie te voorkomen. (B) meting van de lichtintensiteit (bioluminescentie [graven/s]) werd uitgevoerd om 10 min voor 10 h. E. coli lux operon expressie (linkerdeelvenster) ten van P. mandapamensis 27561 (rechtervenster) in LB opzichte is middellange en kunstmatige zee water medium. (C) relatief licht intensiteiten (RLU/OD) van de lux -operon in E. coli (linkerdeel) en P. mandapamensis 27561 (rechtervenster) uitgedrukt worden bepaald door het normaliseren van de Bioluminescentie aan celdichtheid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Vergelijking van de groeikrommes en lichte intensiteiten van E. coli gebaseerd lux genexpressie voor 24 h. De OD bij 650 nm en de intensiteit van de bioluminescentie in tellingen per seconde werden gemeten elke 10 minuten meer dan 24 uur bij 28 ° C. Alle metingen zijn gemiddelde waarden van drie biologische replicatieonderzoeken met vier technische replicatieonderzoeken elke. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. Bovendien, zijn de relatieve lichte intensiteiten (RLU/OD) waar bioluminescentie is genormaliseerd door de celdichtheid vertegenwoordigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Vergelijking van bioluminescente bacterie te evalueren van potentiële quorum sensing verordening. Licht emissie en celdichtheid elke 10 min. voor 10 h worden gemeten en gemiddelde waarden van drie biologische replicatieonderzoeken met vier technische replicatieonderzoeken elke vertegenwoordigen. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. Metingen van Photobacterium mandapamensis TH1 (zwarte vierkantjes), Vibrio harveyi 14126 (grijze cirkels) en Photobacterium mandapamensis S1 (grijze diamanten) werden vergeleken met elkaar; (A) toont de optische dichtheid (OD) bij 650 nm, (B) het licht intensiteit (bioluminescentie [graven/s]), en (C) relatief licht intensiteit (RLU/OD). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 : Bioluminescentie in vloeibare media en op agar platen. (A) 5 L kolf met 2 L LB medium geënt met E. coli BL21 cellen, uiting geven aan de pET28a lux operon plasmide gefotografeerd in daglicht. (B) dezelfde cultuur zoals in (A) gefotografeerd in het donker. Foto's A en B werden ongeveer 2 h genomen na de inductie van expressie. (C) kunstmatige zee water middellange agarplaat met gestreepte cultuur van P. mandapamensis S1 gefotografeerd in het donker. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
De bouw van een plasmide van de expressie met vier fragmenten componeren het hele lux-rib -operon van P. mandapamensis 27561 werd bereikt via Gibson klonen. Deze E. coli gebaseerd lux genexpressie kunt E. coli cellen licht uitstralen. Vermijden van quorum sensing verordening en niet-standaard groei voorwaarden zijn aanzienlijke voordelen van dit systeem.
De voordelen van het gebruik van Gibson klonen strategie zijn de eenvoudige montage van meerdere lineaire DNA-fragmenten, hoge flexibiliteit en geen behoefte aan specifieke beperking sites18,19,20. Deze methode kan om een lux -operon, met uitzondering van enkel gen of genen clusters of introductie van nieuwe genen of uitwisselen van genen van een stam met een ander gemakkelijk te veranderen. Een voorwaarde voor de toepassing van deze methode is de beschikbaarheid van de respectieve lux operon gensequentie. Slechts voor een klein aantal bioluminescente bacterie is de volledige opeenvolging van DNA van het respectieve lux -operon bekend en/of beschikbaar. Veel van deze sequenties zijn gefragmenteerd, omdat ze werden gegenereerd met behulp van shotgun sequencing. In het geval van de onderzochte P. mandapamensis 27561 de volledige opeenvolging van DNA van de lux -operon is bekend en beschikbaar uit de database van de gene NCBI (GenBank: DQ988878.2).
Een kritieke stap in het protocol van de Gibson-vergadering is de berekening van de DNA-concentratie van de fragmenten. In het protocol van de vergadering van de fabrikant het werd aanbevolen het gebruik van 0,2 - 0,5 pmols en een totaal volume van 20 µL voor 4-6 fragmenten20,21. In ons geval, waar luxCDABFEG-ribEBH uit 4 fragmenten bestaat, waren de concentratie en de totale hoeveelheden 0.1 pmol en 45 µL, respectievelijk, afhankelijk van de opbrengst van PCR producten. Aan de ene kant, de concentratie moest worden verminderd en aan de andere kant, het volume moest worden verhoogd. Niettemin, de vergadering gehanteerd welaan en DNA rangschikkend bevestigd het juiste inbrengen bij de eerste poging. Deze bevinding bevestigd Gibson vergadering als een robuuste en geschikte methode voor onze onderzoeken, die gemakkelijk gemodificeerde18,19,20 kunnen.
De nieuw opgerichte plaat lezer assay is een gemakkelijk te hanteren methode. Het maakt een eenvoudige primaire analyse van nieuwe of (on-) bekend bioluminescente bacteriestammen en geeft al een eerste hint op het reguleringsmechanisme van lichte productie (bijvoorbeeld lag in luminescentie op lage cel dichtheden). Daarnaast kunnen de groei voorwaarden in combinatie met lichte productie gemakkelijk worden geëvalueerd door simpelweg het veranderen van groeimedium of temperatuur.
De metingen met de afleesapparaat werden uitgevoerd bij 28 ° C. De reden voor deze ongebruikelijke instelling is de gevoeligheid van de temperatuur van bioluminescente bacteriestammen, waar temperaturen boven 30 ° C leiden tot minder of zelfs geen groei en/of licht emissie. Opmerking, dat de lezer van de plaat staat een gedefinieerde temperatuur houden na verloop van tijd met de beperking van een ontbrekende actieve koeling systeem is. Daarom moet de omgevingstemperatuur onder de temperatuur van de meting.
Als een bewijs van concept, een vergelijking van de constructie van de E. coli met de bioluminescente stam P. mandapamensis (Figuur 5) aan de ene kant en de referentiemetingen (Figuur 4) aan de andere kant werden uitgevoerd en bevestigen de betrouwbaarheid van deze nieuw opgerichte systeem. Daarnaast verzekerd het op lange termijn meten de levensduur van de lichte emissie (Figuur 6). Maar men moet overwegen dat OD-waarden niet betrouwbaar boven een bepaalde optische dichtheid, afhankelijk van de kenmerken van de gebruikte meting apparaat (ongeveer 15 h in het onderhavige geval zijn) waar een aangewezen verdunning nodig zou zijn voor een meting in de lineaire bereik van de detector. Deze hoge varianties in OD-waarden maken deze lange tijdmetingen niet betrouwbaar. Daarom zijn kortere metingen zoals 10u geadviseerd met behulp van de experimentele opstelling gemeld hier.
Beperkingen van de gevestigde plaat lezer bepaling kunnen worden gezien in Figuur 7. Het probleem is het vinden van een juiste instelling van de meting. De 'krijgen waarde' Hiermee past u de gevoeligheid van de foto multiplier buis (PMT). De winst is de versterking van het signaal in de bet, wat betekent dat een hogere winst factor het signaal zal toenemen. Als de winst te laag is ingesteld, de signaal / ruisverhouding groter wordt en lichte intensiteiten van de "lage" lichtend bioluminescente bacterie kunnen niet worden gemeten geen meer (signalen dicht bij nul, gegevens niet worden weergegeven). De uitdaging in een bioluminescente assay is om in te stellen van de winst, zodat de meetresultaten voor alle bacteriestammen binnen het bereik van het instrument blijven. Bovendien, het meetbereik voor luminescentie hangt af van de intervaltijd meting (bijvoorbeeld maximaal 2.000.000 voor 1 s).
De winst was ingesteld op 2800, die is empirisch getest en gekozen voor de lezer van de specifieke plaat die voor de opstelling van deze methode. De instelling van de gebruikte winst staat de opname van maximale uitgestraalde licht door de bioluminescente E. coli systeem, P. mandapamensis 27561 en P. mandapamensis S1 zonder overloop, maar voor de spanningen P. mandapamensis TH1 en V. harveyi 14126 de winst te hoog was. Daarom deze laatste stammen hoger zijn dan de detectiegrens en de echte maximale lichtintensiteit kan niet worden gemeten. Deze technische beperking kan verhinderen dat de vergelijking van bioluminescente bacteriën, die hoge variaties vertonen door maximale licht emissie, hoewel groei-omstandigheden en de bevolkingsdichtheid van de cel vergelijkbaar wellicht.
Positionering van de geanalyseerde bacteriestammen binnen de gebruikte goed platen moet empirisch worden geëvalueerd. Hoewel zwarte goed platen met glazen bodem werden gebruikt, werd Overspraak tussen de monsters waargenomen. De lichtsterkte van specifieke stammen is zo hoog, dat alle naburige putjes valse positieve licht uitstoot (b.v. leeg) zal tonen. Daarom is het belangrijk voor het meten van twee verschillende stammen, hetzij afzonderlijk of met een bepaalde ruimtelijke scheiding aan elkaar.
Er zijn al veel gemodificeerde E. coli stammen bekend die delen van de lux -operon bevatten en zijn voornamelijk toepassingsgericht15,16,17. De hier beschreven methoden gericht op het fundamenteel onderzoek, bijvoorbeeld de mogelijkheid van het analyseren van elk gen lux afzonderlijk. Hoewel onderzoek van bioluminescentie een lange geschiedenis heeft, zijn er nog veel open vragen. Door met uitzondering van invoering van genen uit het operon lux , de luxAB genen met genen van een andere stam uit te wisselen of analyseren van eiwitten complexen, ingebed in het gemakkelijk te hanteren systeem van E. coli en verdere toepassing van de plaat lezer assay, het mogelijk te krijgen meer informatie over de regelgeving en de functies van lux genen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) bedanken voor zijn steun bij de oprichting van het zelfgeschreven script voor de afleesapparaat. Dit werk werd gesteund door de Oostenrijkse "Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung" (FWF) tot uur (P24189) en het PhD-programma "DK Moleculaire enzymologie" (W901) tot uur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
| Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
| GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit | Thermo Scientific | K0721 | for 50 rxn |
| Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit | Promega | A9282 | for 250 rxn |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs Inc. | #T1020S | for 50 rxn |
| GeneJet Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0503 | for 250 rxn |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
| 24-well black sensoplate with glass bottom | Greiner Bio One | 662892 | |
| FLUOStar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
| OPTIMA/Mars Analysis Software | BMG Labtech | Version 2.20 | |
| Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
| Multitron Standard Incubator Shaker | Infors AG |
References
- Widder, E. A. Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity. Science. 328 (5979), 704-708 (2010).
- Dunlap, P. Bioluminescence, Microbial. Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).
- Ulitzur, S., Hastings, J. W. Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence. Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).
- Kurfürst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction. Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).
- Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).
- Meighen, E. A. Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes. FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).
- Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase. J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).
- Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase. EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).
- Moore, S. A., James, M. N. G. Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (βα)8 fold in luciferase. Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).
- Moore, S. A., James, M. N. G. Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 Å resolution. J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).
- Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 Å resolution. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).
- Bergner, T., et al. Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi. Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).
- Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work. ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).
- Meighen, E.
- Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).
- Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology. Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence living lights, lights for living. , Harvard University Press. (2013).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
- NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction. , (2015).
- Atlas, R. M. Handbook of Microbiological Media, Third Edition. , CRC Press. (2004).
