Analyse der N- Glykane von Raphanus Sativus Sorten verwenden PNGase H+
Summary
Wir beschreiben eine einfache und schnelle Methode für die Aufbereitung und Analyse von N– Glykanen aus verschiedenen Sorten von Rettich (Raphanus Sativus).
Abstract
In den letzten Jahren haben die Kohlenhydrat-Moieties Pflanzen beträchtliche Aufmerksamkeit empfangen, da sie eine potentielle Quelle von kreuzreaktiven, Allergie provozieren Immunantworten sind. Darüber hinaus auch spielen Kohlenhydrat-Strukturen eine entscheidende Rolle im Stoffwechsel der Pflanze. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode für die Vorbereitung und Analyse von N– Glykanen aus verschiedenen Sorten von Rettich (Raphanus Sativus) mit einem N– Glycanase speziell für die Freisetzung von pflanzliche Kohlenhydrat-Strukturen. Um dies zu erreichen, wurden grobe Trichloressigsäure Säure Ausscheidungen von Rettich Homogenates mit PNGase H+behandelt und mit 2-aminobenzamid als fluoreszierende Tag gekennzeichnet. Die beschrifteten N– Glycan Proben wurden anschließend durch ultra-Performance liquid Chromatography (UPLC) Trennung und Matrix-assisted Laser Desorption ionisation-Zeit der Massenspektrometrie Flug (MALDI-TOF) für eine detaillierte Struktur-analysiert. Bewertung und die relative Abundancies der Rettich abgeleitet N– Glycan Strukturen zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann auch für die Analyse von N– Glykanen aus verschiedenen anderen Pflanzenarten verwendet werden und kann für weitere Untersuchungen der Funktion und Wirkung von N– Glykanen auf die menschliche Gesundheit nützlich sein.
Introduction
N– Glykane in Pflanzen haben erhöhte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren gezogen, wie die bisherige Forschung N– Glykane als eine potenzielle Quelle für immunologische Kreuzreaktionen hervorhob, die allergische Reaktionen1,2 provozieren kann . Es nachweislich bereits, dass N– Glykane auf Pflanze Glykoproteine katalytische Aktivität3,4, Thermostabilität und klappbare5,6 oder subzelluläre Lokalisierung beeinflussen kann und Sekretion7. Um die Glycan-Strukturen mit ihren jeweiligen Funktionen zu korrelieren, muss N– Glykane zuerst aus Glykoproteinen entweder chemisch oder enzymatisch entlassen werden. Die klassische chemische Methode für die Freigabe von N– und O– Glykanen ist β-Eliminierung, in denen alkalische Probenbehandlung durch Reduktion mit Natriumborhydrid ein Alditol8weichen begleitet wird. Jedoch dieses Verfahren schließt mit einem Fluorophore beschriften und verursacht erhebliche Verfall der Monosaccharid-Einheiten aus der reduzierenden Ende der Glycan Struktur. Chemische Deglycosylation basierend auf Ammonium Hydroxid/Carbonat Behandlung ist auch eine häufig verwendete alternative Methode9. Keines dieser Verfahren chemische Freisetzung verschlechtert intakte Proteine, die massenspektrometrische Analyse der unbeschrifteten Glycan Pools ohne die Einmischung von Peptid-Fragmente in den gleichen Massenbereich ermöglicht. Ein Nachteil dieser Methoden ist jedoch die erhöhte Abbaurate von α1, 3-Fucosylated N– Glykane, eine gemeinsame Struktur der Kohlenhydrate in Pflanzen10gefunden. Alternativ, enzymatischen Freisetzung von Methoden mit Peptid:N– Glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) werden auch eingesetzt. Rekombinante PNGase F (von Flavobacterium Meningosepticum) ist die häufigste Wahl und erlaubt die Freigabe aller Arten von N– Glykanen, außer die Strukturen mit einem Kern α1, 3 Fucose11,12. PNGase A (isoliert aus Mandel Samen) ist daher in der Regel für die Analyse der Anlage N– Glykane13verwendet. Jedoch dieses Enzym Deglycosylates nur proteolytisch abgeleitete Glykopeptide, und ist nicht in der Lage, Deglycosylate native Glykoproteine14. Daher ist eine mehrstufige Probe Aufarbeitung vor weiteren Analyse erforderlich, die umfangreichen Verlust von Glykoproteinen, insbesondere der niedrige Fülle15führt. Das übergeordnete Ziel der Methode ist, einen optimierten Arbeitsfluss für N– Glycan Release und Fluoreszenz-Beschriftung in eine einfache und robuste Art und Weise zu präsentieren. Die zugrunde liegende Logik ist, dass PNGase H+, das war vor kurzem in Terriglobus Roseus entdeckt und in E. Colirekombinant ausgedrückt werden kann, können N– Glykane direkt aus dem Protein-Gerüst in sauren hydrolyseneigung Bedingungen-16. Ein entscheidender Vorteil der Verwendung von PNGase H+ gegenüber alternativen Methoden ist, dass fluoreszierende Kennzeichnung Reaktionen in der selben Reaktionsgefäß durchgeführt werden können, ohne die Reaktion Puffer17,18. Die einfache Zubereitung Bedingungen und hohe Rückgewinnung von niedrig-Fülle Oligosaccharide machen diese Methode ein wertvolles Werkzeug in der Analyse von N– Glykanen. Dieses Protokoll eignet sich für die Analyse der N– Glykane von verschiedenen Pflanzenarten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll, die, das wir hier vorgestellt haben, erlaubt den Vergleich der N– Glycan Profile von verschiedenen Sorten von Rettich. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode im Vergleich zu bestehenden Protokolle ist, dass keine Puffer Änderungen zwischen die enzymatische Freisetzung von N– Glykanen und der Derivatisierung Reaktion mit 2-AB erforderlich sind. Der wichtigste Schritt dieses Verfahrens ist die Reinigung von N– Glykanen mit der Spalte “SPE” als Verstoß gegen Salze zu entfernen od…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch den Natural Science Foundation of China (Zuschuss Zahlen 31471703, A0201300537 und 31671854, j.v. und l.l., Anzahl 31470435 gewähren, G.Y.), und die 100 ausländische Talente Plan (Grant-Nummer JSB2014012, j.v.).
Materials
| Chemicals: | |||
| Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
| Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
| Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
| Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
| 2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
| Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
| 2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
| 6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
| Tools/Materials: | |||
| Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
| Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
| Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
| SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
| HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
| LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
| Formic acid | Aladdin | F112034 | |
| Ammonia solution | Aladdin | A112080 |
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