Análisis de N- glicanos de Raphanus sativus variedades usando PNGasa H+

Summary

Describimos un método simple y rápido para la preparación y análisis de N– glicanos de diferentes variedades de rábano (Raphanus sativus).

Abstract

En los últimos años, las moléculas de hidratos de carbono de las plantas han recibido considerable atención, ya que son una fuente potencial de respuesta inmune cruz-reactivo, que provoca la alergia. Además, estructuras de hidratos de carbono también juegan un papel fundamental en el metabolismo vegetal. Aquí, presentamos un método simple y rápido para la preparación y análisis de N– glicanos de diferentes variedades de rábano (Raphanus sativus) con un N– glycanase específico para la liberación de las estructuras de carbohidratos de origen vegetal. Para lograr esto, los precipitados de homogenados de rábano crudo ácido tricloroacético fueron tratados con PNGasa H⁺y etiquetados utilizando 2-Aminobenzamida como una etiqueta fluorescente. Las etiqueta N– glycan muestras posteriormente fueron analizadas por ultra rendimiento cromatografía líquida (UPLC) separación e ionización-tiempo de desorción láser asistida por matriz de la espectrometría de masas de vuelo (MALDI-TOF) para un detallado estructural evaluación y cuantificar abundancies relativos de las estructuras derivadas de rábano N– glicanos. Este protocolo también puede utilizarse para el análisis de N– glicanos de varias otras especies de plantas y puede ser útil para la investigación adicional de la función y los efectos de N– glicanos en la salud humana.

Introduction

N– glycans en plantas han atraído la atención creciente en los últimos años, como la investigación anterior ha puesto de manifiesto N– glicanos como una fuente potencial de reacciones cruzadas inmunológicas que pueden provocar las respuestas alérgicas^1,2 . Se ha demostrado previamente que N– glycans en glicoproteínas vegetales pueden afectar actividad catalítica^3,4, termoestabilidad y plegable de^5,6 o localización subcelular y secreción⁷. Con el fin de correlacionar las estructuras glicanos con sus respectivas funciones, N– glycans debe primero liberarse de glicoproteínas enzimático o químicamente. El método químico clásico para la liberación de N– y O– glicanos es β-eliminación, en la cual tratamiento alcalino de la muestra se acompaña de reducción con hidruro de boro para producir un alditol⁸. Sin embargo, este procedimiento impide etiquetar con un fluoróforo y causa decaimiento significativo de unidades de monosacárido del extremo reductor de la estructura de glicanos. Deglycosylation química basada en el tratamiento de carbonato de hidróxido de amonio es también un método alternativo utilizado⁹. Ninguno de estos métodos de liberación químico degrada proteínas intactas, que permite el análisis de espectrometría de masa de glicanos piscinas sin la interferencia de los fragmentos de péptido en el mismo rango de masa. Sin embargo, una desventaja de estos métodos es la tasa de degradación creciente de α1, 3 fucosylated N– glycans, una estructura común de carbohidratos encontrados en las plantas¹⁰. Como alternativa, métodos de liberación enzimática utilizando péptidos:N– glicanasas (PNGases, EC 3.5.1.52) se aplican también extensamente. Recombinante PNGasa F (de Flavobacterium meningosepticum) es la opción más común y permite la liberación de todos los tipos de N– glicanos, excepto las estructuras teniendo un núcleo α1, fucosa 3^11,12. Por lo tanto, A PNGasa (aislada de semillas de almendra) se utiliza generalmente para el análisis de planta N– glycans¹³. Sin embargo, esta enzima deglycosylates sólo proteolytically derivados de glicopéptidos y es incapaz de deglycosylate nativo glicoproteínas¹⁴. Por lo tanto, es necesaria un workup muestra varios pasos antes de análisis, que causa pérdida extensa de glycans, especialmente aquellos de baja abundancia¹⁵. El objetivo del método es presentar un flujo de trabajo optimizado para el lanzamiento de N– glicanos y fluorescencia de etiquetado de una manera sencilla y robusta. La lógica subyacente es que PNGasa H⁺, que fue descubierto recientemente en Terriglobus roseus y puede ser por vía recombinante expresada en e. coli, puede hidrolizar N– glycans directamente desde el andamio de proteínas en ácidos condiciones¹⁶. Una ventaja clave de usar PNGasa H⁺ sobre métodos alternativos es que reacciones Etiquetadoras fluorescentes se pueden realizar en el mismo tubo de reacción sin modificar la reacción buffers^17,18. Las condiciones de preparación simple y alta recuperación de baja abundancia oligosacáridos hacen este método una valiosa herramienta en el análisis de N– glicanos. Este protocolo es adecuado para el análisis de N– glicanos de varias especies de plantas.

Protocol

1. muestras Adquirir diferentes variedades de fresco rábano (Raphanus sativus L.). 2. aislamiento de proteína de rábano Homogeneizar aproximadamente 100 g de rábanos frescos con una licuadora de cocina durante 10 minutos. Transferir la mezcla a un tubo de centrífuga de 50 mL y centrifugar a 14.000 × g a 4 ° C por 20 min eliminar el material insoluble. Transferir el sobrenadante con cuidado en un nuevo tubo de centrífuga de…

Representative Results

La figura 1 muestra una descripción esquemática del protocolo descrito, incluyendo el aislamiento de (glico) proteínas de rábano, la preparación de N- glicanos, el análisis UPLC y el MALDI-TOF-MS en análisis de estos componentes. La figura 2 muestra representativos cromatogramas UPLC de N- glycans derivatizados de los cultivares analizados rábano. La figura 3 muestra los res…

Discussion

El protocolo que hemos presentado aquí permite la comparación de los N– glicanos perfiles de distintas variedades de rábano. Una importante ventaja de este método en comparación con los protocolos existentes es que no hay cambios de tampón entre la liberación enzimática de N– glicanos y la reacción de derivatización con 2 AB son necesarios. El paso más crítico de este procedimiento es la purificación de N– glycans utilizando la columna SPE, como fracaso para eliminar las sales o im…

Materials

Chemicals:
Trichloroacetic acid	SCR, Shanghai	80132618
Acetic acid glacial	Huada, Guangzhou	64-19-7
Acetonitrile	General-reagent	G80988C
Trifluoroacetic acid	Energy chemical	W810031
2-aminobenzamide	Heowns, Tianjin	A41900
Sodium cyanoborohydride	J&K Scientific Ltd	314162
Dimethyl sulfoxide	Huada, Guangzhou	67-68-5
2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol	Agilent Technologies	AT-5190-6998
6-Aza-2-thiothymine	Sigma	275514
Tools/Materials:
Kitchen blender	Bear, Guangzhou	LLJ-A10T1
Centrifuge	Techcomp	CT15RT
Centrifugal Evaporator	Hualida, Taicang	LNG-T120
SPE column	Supelco	Supelclean ENVI Carb SPE column
MALDI-TOF mass spectrometer	Bruker	Autoflex
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	# 5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
Column oven	Hengxin	CO-2000
HPLC Column	Waters	Acquity UPLC BEH glycan column	2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size
LCMS-grade Water	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	# 100029
Formic acid	Aladdin	F112034
Ammonia solution	Aladdin	A112080