Saccharomyces cerevisiae Métabolique marquage avec 4-thio-uracile et la Quantification des nouvellement synthétisé ARNm comme un Proxy pour l’activité de l’ARN polymérase II
Summary
Le protocole décrit ici est basé sur la quantification de Génome-large d’ARNm nouvellement synthétisées purifiée à partir de cellules de levure marquées avec 4-thio-uracile. Cette méthode permet de mesurer la synthèse d’ARNm dételée de désintégration de l’ARNm et, par conséquent, donne une mesure précise de la transcription de l’ARN polymérase II.
Abstract
Globales défauts de transcription de l’ARN polymérase II pourraient être négligées par transcriptomique études analysant stationnaire RNA. En effet, la diminution globale de synthèse de l’ARNm s’est avérée être compensée par une baisse simultanée de la dégradation de l’ARNm pour rétablir l’équilibre des niveaux normaux. Par conséquent, la quantification du génome entier de la synthèse de l’ARNm, indépendamment de la désintégration de l’ARNm, est le meilleur reflet direct de l’activité transcriptionnelle de RNA polymérase II. Ici, nous discutons d’une méthode à l’aide de marquage métabolique non perturbant d’ARN naissante chez Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). En particulier, les cellules sont cultivées pendant 6 min avec un uracile analogiques, 4 thio-uracile et le RNAs nouvellement transcrit étiqueté sont purifié et quantifié pour déterminer le taux de synthèse de l’ARNm individuels tous les. En outre, à l’aide d’étiqueté Schizosaccharomyces pombe cellules comme étalon interne permet de comparer la synthèse de l’ARNm dans différentes S. cerevisiae souches. Utilisant ce protocole et ajustement des données avec un modèle cinétique dynamique, les taux de décroissance ARNm correspondants peuvent être déterminées.
Introduction
Les cellules répondent aux signaux endogènes et exogènes, par le biais de la modification dynamique de leur programme d’expression de gène. Ces dernières années, un formidable développement de méthodologies de Génome-large permet la description précise et complète du transcriptome changements dans différentes conditions. Dans la plupart des études de transcriptomique, microarray hybridation ou haut débit séquençage sont utilisés pour quantifier les niveaux d’ARN d’une fraction de RNA totale stationnaire. Transcriptionnelles modifications sous une perturbation spécifique peuvent afficher un large éventail de résultats possibles, avec les modifications de l’expression génique spécifique ou un large spectre de gènes étant up – ou réprimés. L’expression des gènes est le résultat d’un équilibre finement élaboré — ou stationnaire — entre la synthèse de l’ARN par des ARN polymérases et autres processus influant sur les niveaux d’ARN. Transcription de l’ARN polymérase II, y compris ses trois phases distinctes (initiation, élongation et résiliation), sont hautement et intimement associé à traitement ARNm, exportation cytoplasmique, traduction et de dégradation.
Plusieurs études récentes ont démontré que la décomposition et la synthèse de l’ARNm sont des mécanismes couplés et a montré que transcriptionnelles effets sur mutation ou sous des stimuli peuvent être négligés lors de la quantification de l’ARN total stationnaire. Tout d’abord, la détection de changements transcriptionnelles par le biais de l’analyse de l’équilibre des niveaux d’ARNm toujours dépend de l’ARNm Half-Life. Dès que la perturbation est introduite, les niveaux d’équilibre des ARNm ayant une demi-vie longue seront beaucoup moins affectées que celles des ARNm ayant une demi-vie courte. Par conséquent, la détectabilité des changements dans la synthèse d’ARN fortement biaisée en faveur des transcriptions de courte durée, alors que l’analyse des vécus ARNm espèces risquent de ne pas révéler l’évolution dynamique du taux de transcription. Deuxièmement, plusieurs rapports ont montré que, tant chez les levures et les mammifères, les changements globaux dans la transcription pourraient être négligées lorsqu’on analyse les niveaux d’équilibre de l’ARNm. C’est probablement due à des mécanismes qui lient la synthèse de l’ARNm et dégradation aboutissant à la mise en mémoire tampon des ARNm. Cela a incité le développement de nouveaux protocoles pour quantifier la synthèse d’ARNm dételée de dégradation, par le biais de l’analyse de l’ARNm nouvellement transcrites. Ces dernières années, plusieurs alternatives ont été présentées, dont le séquençage exécuter-sur global (GRO-seq)1et transcription élongation native séquençage (NET-seq)2,3. Ici, nous vous présentons un protocole initialement développé dans les cellules de mammifères4,5,6 et ensuite adapté à levure7,8,9,10, 11, qui est basé sur RNA marquage avec un nucléoside THIOLÉS ou base analogique, 4-thiouridine (4sU) ou 4-thio-uracile (4tU), respectivement.
Cette méthode spécifiquement purifie ARN nouvellement transcrite les cellules dans les ARN sont marqués au pouls avec 4sU avec pratiquement aucune interférence dans l’homéostasie cellulaire. Par conséquent, une fois que les cellules sont exposées à 4sU, la molécule est rapidement absorbée, phosphorylé en triphosphate-4sU et incorporé dans l’ARN étant transcrite. Une fois marqué impulsion, il est possible d’extraire l’ARN cellulaire total (correspondant aux niveaux d’équilibre de l’ARN), et, par la suite, la fraction d’ARN marqué 4sU est thiol-spécifiquement modifié, conduisant à la formation d’un pont disulfure entre la biotine et la nouvellement transcrites RNA4,5. Cependant, 4sU ne peut être absorbée par les cellules exprimant un transporteur de nucléosides, comme le transporteur de nucléosides équilibrant humaine (hENT1), empêchant son utilisation immédiate chez les levures bourgeonnantes ou fission. Alors qu’on pourrait exprimer hENT1 dans S. pombe ou S. cerevisiae, une approche plus facile peut être réalisée à l’aide de la 4tU base modifiée, car les cellules de levure peuvent faire 4tU, sans avoir besoin d’expression d’un nucléoside transporteur10, 11 , 12 , 13. en effet, le métabolisme du 4tU requiert l’activité de l’enzyme uracile phosphoribosyltransférase (UPRT). Plusieurs organismes, y compris les levures mais pas de mammifères, UPRT est essentiel pour une voie de récupération des pyrimidines, recyclage uracile à l’uridine monophosphate.
Un biais important dans les études de transcriptomique peuvent être introduit par la normalisation entre les différents échantillons analysés en parallèle. En effet, de nombreux facteurs qui DÉVIES peuvent affecter l’analyse du transcriptome de mutant et de souches sauvages : l’efficacité de la lyse cellulaire, les différences dans l’extraction et la récupération de l’ARN et les écarts dans l’étalonnage du scanner pour les analyses de microarray , entre autres. Comme indiqué plus haut, ces variations peuvent être particulièrement trompeuses lorsque les effets globaux sur la transcription de l’ARN polymérase II sont supposés. Un élégant moyen de comparer avec précision les taux de synthèse d’ADN messagère entre différents échantillons a été conçu à l’aide de la levure de fission lointainement connexe Schizosaccharomyces pombe comme étalon interne. Pour cela, un nombre fixe de marquées S. pombe cellules est ajouté aux échantillons de S. cerevisiae , cellules sauvage ou mutants, avant la lyse cellulaire et RNA extraction10. Par la suite, RNAs stationnaire et nouvellement synthétisées de S. pombe et S. cerevisiae sont quantifiées par RT-qPCR ou via l’utilisation de copeaux de microarray ou séquençage haut-débit10. En combinant ces données avec modélisation cinétique, on peuvent mesurer les taux absolus de la synthèse de l’ARNm et la décomposition dans la levure de bière.
Dans le cadre de ce manuscrit, nous allons montrer comment l’analyse de l’ARN transcrit nouvellement autorisé à révéler un rôle global pour les complexes de coactivateur SAGA et TFIID dans RNA polymérase II transcription en bourgeonnement levure14,15, 16. Ce qui est important, des études antérieures quantifier les niveaux d’ARNm stationnaire chez S. cerevisiae et a suggéré que la SAGA joue un rôle prédominant sur un nombre limité de gènes de levure qui sont fortement touchés par des mutations dans la SAGA mais relativement résistants à TFIID les mutations17,18,19. Étonnamment, l’activité de la SAGA qui ont été montrées pour agir sur le génome entier transcrit, suggérant un rôle plus large pour cet co activateur de transcription de l’ARN polymérase II. Une diminution RNA polymérase II le recrutement à gènes exprimés plus a été observé sur l’inactivation de la SAGA ou TFIID, suggérant que ces coactivateurs collaborent à la plupart des gènes. Par conséquent, la quantification des ARNm transcrit nouvellement révélé que SAGA et TFIID sont nécessaires pour la transcription des gènes de la quasi-totalité de la RNA polymérase II14,15,16. La mise en œuvre de mécanismes compensatoires émerge comme un moyen pour les cellules faire face à une diminution globale de synthèse des ARNm qui est protégée par une baisse simultanée des mondiale dans la dégradation de l’ARNm. SAGA ajoute à la liste des facteurs qui ont un effet global sur la RNA polymérase II la transcription, comme l’ARN Pol II sous-unités10, le médiateur coactivateur complexe20, le général transcription facteur TFIIH21,22 et indirectement, les éléments de l’ARNm dégradation machines9,10,23. Tels événements compensatoires ont été universellement observés chez les mutants SAGA, tenir compte des modifications dans les niveaux d’ARNm équilibre malgré une diminution globale et sévère à l’ARNm synthèse14modestes et limitées. Des analyses similaires ont aussi été réalisées dans une souche de suppression de BRE1 , ce qui entraîne une perte complète de l’histone H2B ubiquitination. Fait intéressant, un beaucoup plus doux mais cohérent global d’effet sur la transcription de l’ARN polymérase II pourrait être détecté en l’absence de Bre1, ce qui indique que le marquage métabolique de l’ARN nouvellement transcrite dans la levure peut détecter et quantifier un large éventail de changements dans l’ARNm taux de synthèse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alors que le génome des outils pour analyser les changements dans la transcription sont améliorent encore, la seule analyse du transcriptome par le biais de la quantification des niveaux d’équilibre de l’ARN pourrait reflètent pas exactement les changements dans l’activité d’ARN polymérase II. En effet, les niveaux d’ARNm sont réglementés non seulement par la synthèse de l’ARN, mais aussi par leur maturation et leur dégradation. Pour mesurer la synthèse d’ARNm dételée de dégradation de l’ARN…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Laszlo Tora pour son soutien et V. Fisher, K. Schumacher et F. El Saafin pour leurs discussions. C.T. a été soutenue par une bourse Marie Curie-ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) et l’ARC de la Fondation. Ce travail a été soutenu par des fonds de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Cette étude a été soutenue également par l’ANR-10-LABX-0030-INRT, un fonds de l’État Français géré par l’Agence Nationale de la Recherche dans le cadre programme Investissements d’avenir ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| 4-Thiouracil | Sigma-Aldrich | Cat# 440736 | |
| Rapamycin | Euromedex | Cat# SYN-1185 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher | N/A | |
| RiboPure RNA Purification kit, yeast | ThermoFisher | Cat# AM1926 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | |
| EZ-Link HPDP Biotin | ThermoFisher | Cat# 21341 | |
| Thiolutin | Abcam | ab143556 | |
| µMACS Streptavidin kit | Miltenyi Biotec | Cat# 130-074-101 | |
| Transcriptor Reverse Transcriptase | Roche | 03 531 295 001 | |
| SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| GeneChip Yeast Genome 2.0 | ThermoFisher | 900555 | |
| GeneChip Fluidics Station 450 | ThermoFisher | 00-0079 | |
| GeneChip Scanner 3000 7G | ThermoFisher | 00-0210 |
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