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Génétique

Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II

Published: October 22, 2018
doi:
10.3791/57982
,
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch, France, 2Centre National de la Recherche Scientifique, Illkirch, France, 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Illkirch, France, 4Université de Strasbourg

Summary

El protocolo aquí descrito se basa en la cuantificación del genoma de mRNA recién sintetizada purificada de células de levadura con 4-tiouracilo. Este método permite para medir la síntesis de mRNA desacoplado del decaimiento del mRNA y por lo tanto, proporciona una medida exacta de la transcripción del RNA polimerasa II.

Abstract

Globales defectos en la transcripción del RNA polimerasa II podrían dominados por transcriptómicos estudios análisis de RNA de estado estacionario. De hecho, la disminución global en la síntesis de ARNm ha demostrado ser compensado por una disminución simultánea en la degradación del mRNA para restaurar los niveles de estado estacionario normales. Por lo tanto, la cuantificación del genoma de la síntesis de mRNA, independientemente del decaimiento del mRNA, es el mejor reflejo directo de la actividad transcripcional de RNA polimerasa II. Aquí, discutimos un método usando el etiquetado metabólico no perturbar de ARN naciente en Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). En concreto, las células se cultivan para el minuto 6 con un uracilo analógico, 4-tiouracilo y el etiquetado ARN recién transcrito es purificado y cuantificado para determinar las tasas de síntesis de los ARNm individuales. Por otra parte, utilizando etiquetado Schizosaccharomyces pombe células como estándar interno permite comparar la síntesis de mRNA en S. cerevisiae de diferentes cepas. Usando este protocolo y montaje de los datos con un modelo cinético dinámico, se pueden determinar las tasas de decaimiento de ARNm correspondiente.

Introduction

Las células responden a estímulos endógenos y exógenos, a través de la alteración de la dinámica de su programa de expresión génica. En los últimos años un enorme desarrollo de metodologías de genoma permite la descripción precisa y completa de transcriptoma cambios en diferentes condiciones. En la mayoría de los estudios de transcriptómicos, microarray hibridación o alto rendimiento de secuenciación se utilizan para cuantificar niveles de ARN de una fracción de RNA total de estado estacionario. Cambios transcripcionales bajo una perturbación específica pueden mostrar una amplia gama de resultados posibles, con un amplio espectro de genes ser para arriba – u o o cambios de expresión del gen específico. Expresión génica es el resultado de un equilibrio optimizado, o estado estacionario, entre la síntesis de RNA por polimerasas del RNA y otros procesos que afectan a niveles de ARN. Transcripción de ARN polimerasa II, incluyendo sus tres fases (iniciación, elongación y terminación), es altamente y estrechamente asociado con procesamiento de mRNA, exportación citoplasmática, traducción y degradación.

Varios estudios recientes demostraron que descomposición y síntesis de mRNAs son mecanismos acoplados y demostraron que efectos transcripcionales a mutación o bajo estímulos pueden ser pasado por alto cuando la cuantificación de ARN total de estado estacionario. En primer lugar, la detección de cambios transcripcionales a través de los análisis de los niveles de estado estacionario de mRNA siempre depende de mRNAs Half-Life. Una vez que la perturbación se introduce, los niveles de estado estacionario de mRNAs con vida media larga se verá afectados mucho menos que los mRNAs con una vida media corta. Por lo tanto, la detección de los cambios en la síntesis de ARN es sesgada fuertemente a favor de las transcripciones de breve duración, mientras que el análisis de especies de mRNA perdurable puede no revelar cambios dinámicos en la tasa de transcripción. En segundo lugar, varios informes han demostrado que, tanto en levaduras y mamíferos, cambios globales en la transcripción pueden ser pasado por alto al analizar los niveles de estado estacionario de mRNA. Esto es probablemente debido a los mecanismos que vinculan la síntesis de mRNA y degradación resultante en mRNA buffering. Esto incitó el desarrollo de nuevos protocolos para cuantificar la síntesis de mRNA desacoplado de la degradación, a través del análisis del ARNm recién transcrita. En los últimos años, se presentan varias alternativas, incluyendo la secuencia funcionamiento global (GRO-seq)1y transcripción elongación nativo secuenciación (NET-seq)2,3. Aquí, presentamos un protocolo, desarrollado inicialmente en células de mamíferos4,5,6 y luego adaptado a levadura7,8,9,10, 11, que se basa en RNA etiquetado con un nucleósido thiolated o base analógica, 4-thiouridine (4sU) o 4-tiouracilo (4tU), respectivamente.

Este método específicamente purifica ARN recién transcrito de las células en el que ARN son pulso marcado con 4sU prácticamente sin interferencia en la homeostasis celular. Por lo tanto, una vez que las células se exponen a 4sU, la molécula es rápidamente captados, fosforila a 4sU-trifosfato e incorporada en el ARN se transcribe. Una vez que pulso marcado, es posible extraer ARN celular total (correspondientes a niveles de estado estacionario del ARN) y, posteriormente, la fracción de RNA marcado con 4sU es tiol-específicamente modificado, dando lugar a la formación de un enlace disulfuro entre biotina y recién transcrito RNA4,5. Sin embargo, 4sU sólo pueden ser captados por las células expresando un transportador de nucleósidos, como el transportador de nucleósidos equilibrative humano (hENT1), impidiendo su uso inmediato en la levadura de gemación o fisión. Mientras que uno podría expresar hENT1 en S. pombe o en S. cerevisiae, se logra un acercamiento más fácil utilizando el 4tU base modificado, puesto que las células de levadura pueden tomar 4tU, sin la necesidad de expresión de un transportador de nucleósidos10, 11 , 12 , 13. de hecho, el metabolismo de 4tU requiere la actividad de la enzima uracilo fosforribosiltransferasa (UPRT). En varios organismos, incluyendo la levadura pero no mamíferos, UPRT es esencial para una vía de salvamento de pirimidina, reciclaje uracilo a monofosfato de uridina.

Un importante sesgo en estudios transcriptómicos puede ser introducido por la normalización entre diferentes muestras analizadas en paralelo. De hecho, muchos factores de la desviación pueden afectar el análisis comparativo del transcriptoma de cepas de tipo salvaje y mutante: la eficiencia de la lisis celular, las diferencias en la extracción y recuperación del RNA y las variaciones en la calibración del escáner para análisis de microarray , entre otros. Como hemos comentado anteriormente, estas variaciones pueden ser particularmente engañosas cuando se espera que los efectos globales en la transcripción del RNA polimerasa II. Un medio elegante para comparar con precisión las tasas de síntesis de mRNA entre diferentes muestras fue diseñado mediante el uso de la levadura del distante relacionado fisión Schizosaccharomyces pombe como estándar interno. Para ello, un número fijo de etiquetado S. pombe células se añade a las muestras de S. cerevisiae , células de tipo salvaje o mutantes, antes de la lisis celular y extracción de RNA10. Posteriormente, estado estacionario y recién sintetizados RNAs de S. pombe y S. cerevisiae se cuantifican por RT-qPCR o mediante el uso de chips de microarray o secuenciación de alto rendimiento10. Combinando estos datos con el modelado cinético, se pueden medir tasas absolutas de la síntesis de mRNA y decaimiento en levadura de florecimiento.

En el marco de este manuscrito, nos mostrará cómo el análisis del ARN recién transcrito permitió revelar un papel global para los complejos del coactivator SAGA y TFIID transcripción del RNA polimerasa II en florecimiento levadura14,15, 16. Lo importante, últimos estudios cuantificaron niveles de mRNA de estado estacionario en S. cerevisiae y sugirieron que SAGA desempeña una función predominante en un conjunto limitado de genes de levadura que son fuertemente afectadas por mutaciones en SAGA pero relativamente resistente a TFIID las mutaciones17,18,19. Sorprendentemente, las actividades enzimáticas de la SAGA fueron demostradas para actuar sobre el genoma transcrito entero, sugiriendo un papel más amplio para este coactivador en la transcripción del RNA polimerasa II. Se observó menor reclutamiento de RNA polimerasa II en genes más expresados sobre la inactivación de la SAGA o TFIID, sugiriendo que estos activación trabaja juntos en la mayoría de los genes. Por lo tanto, la cuantificación de ARNm recién transcrita reveló que SAGA y TFIID son necesarios para la transcripción de casi todos los genes de la RNA polimerasa II14,15,16. La implementación de mecanismos de compensación surge como una forma de las células hacer frente a una disminución global en la síntesis de mRNA que es protegida por una simultánea disminución global en la degradación del mRNA. SAGA suma a la lista de factores con un efecto global en la transcripción del RNA polimerasa II, como subunidades de ARN Pol II10, el mediador del coactivator complejo20, el general transcripción factor TFIIH21,22 e indirectamente, elementos de mRNA degradación maquinaria9,10,23. Tales eventos compensatorios universalmente fueron observadas en mutantes de la SAGA, son responsables de los cambios en los niveles de mRNA de estado estable a pesar de una disminución global y severo de la síntesis de mRNA14modestos y limitados. Análisis similares se realizaron en una cepa de eliminación BRE1 , resultando en una pérdida completa de ubiquitinación de histona H2B. Curiosamente, un mucho más suave pero consistente efecto global en la transcripción del RNA polimerasa II se podría detectar en ausencia de Bre1, indicando que el etiquetado metabólico del ARN recién transcrito en la levadura puede detectar y cuantificar una gran variedad de cambios en el ARNm tasas de síntesis.

Protocol

1. célula de cultivo y el agotamiento de la rapamicina de una subunidad de la SAGA Para cada cepa de S. cerevisiae y repetición, incluyendo tipo o cepas de control, inocular una colonia solo de un plato fresco en 5 mL de medio YPD (2% peptona, extracto de levadura 1% y 2% de glucosa). Cultivar células de S. cerevisiae durante la noche a 30 ° C con agitación constante (150 rpm). Medir la densidad óptica a 600 nm (OD600) y diluir la cultura a un OD600</s…

Representative Results

Cuando se realiza el etiquetado metabólico del ARN recién transcrito, varios aspectos que controlar: el tiempo y la eficiencia de la rotulación, la proporción de espiga en, el protocolo de extracción y la eficacia de Biotinilación (incluyendo signal to noise ratio), entre otros. Estas condiciones han sido extensivamente y metódicamente demostradas por otros7,10,11. Aquí nos centramos prin…

Discussion

Mientras todavía están mejorando herramientas de genoma para analizar cambios en la transcripción, el único análisis de transcriptoma a través de la cuantificación de los niveles de estado estacionario del ARN podría no reflejan cambios en la actividad de RNA polimerasa II. De hecho, niveles de ARNm están regulados no sólo por la síntesis de ARN, sino también por su maduración y degradación. Para medir la síntesis de mRNA desacoplado de la degradación del mRNA, distintos protocolos se han desarrollado en …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Laszlo Tora por su apoyo y V. Fisher, Schumacher K. y F. El Saafin para sus discusiones. T.B. fue apoyado por una beca Marie Curie ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) y la Fundación arco. Este trabajo fue financiado por los fondos de la Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Este estudio fue apoyado también por ANR-10-LABX-0030-INRT, un fondo del Estado francés a cargo de la Agence Nationale de la Recherche en el marco programa Investissements Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

Materials

4-Thiouracil Sigma-Aldrich Cat# 440736
Rapamycin Euromedex Cat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell Counter ThermoFisher N/A
RiboPure RNA Purification kit, yeast ThermoFisher Cat# AM1926
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
TURBO DNA-free Kit ThermoFisher AM1907
EZ-Link HPDP Biotin ThermoFisher Cat# 21341
Thiolutin Abcam ab143556
µMACS Streptavidin kit Miltenyi Biotec Cat# 130-074-101
Transcriptor Reverse Transcriptase Roche 03 531 295 001
SYBR Green I Master Roche 4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0 ThermoFisher 900555
GeneChip Fluidics Station 450 ThermoFisher 00-0079
GeneChip Scanner 3000 7G ThermoFisher 00-0210
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Keywords: Saccharomyces CerevisiaeMetabolic Labeling4-thiouracilQuantificationNewly Synthesized MRNARNA Polymerase II ActivityMicroarray HybridizationHigh-throughput SequencingS. PombeYPD MediumYAS MediumCell CountingCell CentrifugationRNA ExtractionRNA Polymerase II
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Citer Cet Article
Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. J. Vis. Exp. (140), e57982, doi:10.3791/57982 (2018).
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