Saccharomyces cerevisiae الأيضية وسم مع 4-ثيوراسيل والتحديد الكمي حديثا توليفها مرناً كوكيل للنشاط الثاني رنا بوليميراز
Summary
البروتوكول هو موضح هنا يستند إلى التحديد الكمي للمركب حديثا مرناً تنقيته من خلايا الخميرة المسمى مع 4-ثيوراسيل على نطاق الجينوم. هذا الأسلوب يسمح بقياس توليف مرناً فصل من تسوس مرناً، ويوفر بالتالي، قياس دقيق للحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ.
Abstract
قد التغاضي عن العيوب العالمي في الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ بالدراسات ترانسكريبتوميك تحليل الحمض النووي الريبي في حالة مستقرة. في الواقع، قد تبين الانخفاض العالمي في توليف مرناً تعويض انخفاض متزامنة في تدهور مرناً لاستعادة مستويات مستقرة العادي. ومن ثم فهو التحديد الكمي على نطاق الجينوم لتوليف مرناً، بمعزل عن اضمحلال مرناً، انعكاس مباشر أفضل من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخي نشاط. وهنا نناقش أسلوب استخدام غير مقاومة وسم الأيضية للكشف الوليدة في Saccharomyces cerevisiae (س. سيريفيسيا). على وجه التحديد، تستزرع الخلايا لمدة 6 دقائق مع اليوراسيل تناظرية، 4 ثيوراسيل، وتنقية الكشف حديثا يدون المسمى وكمياً لتحديد معدلات توليف جميع مرناً الفردية. وعلاوة على ذلك، باستخدام المسمى بومبي شيزوساكتشاروميسيس الخلايا كما قياسي الداخلية تسمح بمقارنة توليف مرناً في مختلف S. cerevisiae سلالات. باستخدام هذا البروتوكول وتركيب البيانات مع نموذج دينامي حركية، يمكن تحديد معدلات تسوس مرناً المناظرة.
Introduction
الخلايا تستجيب لمنبهات داخلية وخارجية، من خلال تغيير دينامية لبرنامجهم التعبير الجيني. في السنوات الأخيرة، تطورا هائلا للمنهجيات على نطاق الجينوم يسمح الوصف الدقيق والشامل للتغييرات الترنسكربيتوم في ظروف مختلفة. في معظم الدراسات ترانسكريبتوميك، تستخدم تسلسل ميكرواري التهجين أو الفائق لقياس مستويات الحمض النووي الريبي من كسر الجيش الملكي النيبالي مجموع حالة مستقرة. يمكن عرض التغييرات النسخي تحت اضطراب محددة طائفة واسعة من النتائج المحتملة، مع تغييرات التعبير جين معين أو طائفة كبيرة من الجينات حتى-أو دوونريجولاتيد. التعبير الجيني هو نتيجة لتوازن صقل — أو الحالة المستقرة – بين العمليات الأخرى التي تؤثر على مستويات الحمض النووي الريبي وتوليف الحمض النووي الريبي بالحمض النووي الريبي [بولمرس]. رنا بوليميراز الثاني النسخ، بما في ذلك على ثلاث مراحل متميزة (استهلال واستطالة والإنهاء)، يرتبط ومعقد للغاية مع تجهيز مرناً وتصدير هيولى، والترجمة، وتدهور.
عدة دراسات أجريت مؤخرا أظهرت أن توليف مرناس والانحلال إلى جانب الآليات وأظهرت أنه يمكن إغفال النسخي آثار الطفرة أو تحت المحفزات عند التحديد الكمي لمجموع الحالة المستقرة الجيش الملكي النيبالي. أولاً، الكشف عن التغيرات النسخي من خلال تحليل مستويات مستقرة مرناً دائماً يعتمد على عمر مرناس. متى يتم عرض اضطراب، مستويات مستقرة مرناس مع نصف حياة طويلة سوف تتأثر أقل بكثير من تلك التي مرناس مع نصف حياة قصيرة. ولذلك، إمكانية الكشف عن التغييرات في توليف الحمض النووي الريبي هو بقوة منحازة لصالح النصوص لم تدم طويلاً، في حين قد يفشل تحليل أطول عمرا من الأنواع مرناً للكشف عن التغيرات الدينامية في معدل النسخ. ثانيا، أظهرت عدة تقارير، كل من الخميرة والثدييات، قد تجاهل التغيرات العالمية في النسخ عند تحليل مستويات الحالة المستقرة مرناً. ومن المرجح بسبب الآليات التي تربط بين التوليف مرناً وتدهور الناتج في التخزين المؤقت مرناً. وهذا دفع تطوير بروتوكولات جديدة التحديد الكمي لتوليف مرناً فصل من تدهور، ومن خلال تحليل مرناً يدون حديثا. في السنوات الأخيرة، تم تقديم العديد من البدائل، بما في ذلك تسلسل التحضير العالمية (غرو-seq)1، ونسخة أصلية استطالة التسلسل (صافي-seq)2،3. نحن هنا، تقديم بروتوكول وضعت في البداية في خلايا الثدييات4،،من56 وتكييفها مع الخميرة7،،من89،10، ثم 11، الذي يرتكز على الحمض النووي الريبي وسم مع نوكليوزيد ثيولاتيد أو قاعدة تمثيلية، 4-ثيوريديني (4sU) أو 4-ثيوراسيل (4tU)، على التوالي.
هذا الأسلوب على وجه التحديد ينقي رنا يدون حديثا من الخلايا في الحمض النووي الريبي التي هي نبض المسمى مع 4sU مع تقريبا أي تدخل في التوازن الخلية. ومن ثم، عندما تتعرض الخلايا ل 4sU، الجزيء سرعة أوبتاكين، فوسفوريلاتيد إلى 4sU-ثلاثي الفوسفات، وأدرج في الكشف يتم نسخها. بمجرد تعديل نبض المسمى، فمن الممكن لاستخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي الخلوية (المقابلة لمستويات مستقرة من الحمض النووي الريبي)، وفيما بعد، كسر الجيش الملكي النيبالي المسمى 4sU ثيول-على وجه التحديد، مما يؤدي إلى تشكيل رابطة ثنائي كبريتيد بين البيوتين الجيش الملكي النيبالي يدون حديثا4،5. ومع ذلك، لا يمكن 4sU أوبتاكين خلايا معربا عن نوكليوزيد الناقل، مثل الناقل نوكليوزيد اكويليبراتيفي البشرية (hENT1)، منع استخدامها الفوري في مهدها أو انشطار الخميرة. بينما واحدة يمكن التعبير عن hENT1 في بومبي س. أو . س. سيريفيسيا، نهج أسهل يمكن تحقيقه باستخدام 4tU القاعدة المعدلة، حيث يمكن أن يستغرق خلايا الخميرة 4tU، دون الحاجة إلى التعبير عن الناقل نوكليوزيد10، 11 , 12 , 13-وفي الواقع، يتطلب أيض 4tU نشاط فوسفوريبوسيلترانسفيريز اليوراسيل إنزيم (أوبرت). في الكائنات الحية عدة، بما في ذلك الخميرة ولكن ليس من الثدييات، أوبرت أمر ضروري لمسار إنقاذ بيريميدين، إعادة تدوير اليوراسيل لاردين الأدينوزين.
ويمكن إدخال انحياز هاما في الدراسات ترانسكريبتوميك بالتطبيع بين العينات المختلفة التي تم تحليلها بالتوازي. وفي الواقع، يمكن أن تؤثر على العديد من العوامل ينحرف التحليل المقارن الترنسكربيتوم المسخ والسلالات البرية من نوع: كفاءة تحلل الخلية، الاختلافات في الاستخراج، والانتعاش من الجيش الملكي النيبالي، والفروق في معايرة الماسح الضوئي لتحليلات ميكرواري ، بين أمور أخرى. كما نوقش أعلاه، يمكن أن مثل هذه الاختلافات مضللة لا سيما عندما يتوقع الآثار العالمية على الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ. تم تصميم وسيلة أنيقة لدقة مقارنة معدلات التوليف مرناً بين العينات المختلفة باستخدام الخميرة الأنشطار بعيد يتصل بومبي شيزوساكتشاروميسيس كمعيار داخلية. لذلك، يسمى عدد ثابت من بومبي س. يتم إضافة خلايا إلى أن العينات S. cerevisiae والخلايا البرية من نوع أو متحولة، قبل تحلل الخلية والحمض النووي الريبي استخراج10. وفي وقت لاحق، كمياً الكشف حالة ثابتة والمركبة حديثا من بومبي س. و . س. سيريفيسيا أما بواسطة RT-قبكر أو عن طريق استخدام رقائق ميكرواري أو التسلسل الفائق10. الجمع بين هذه البيانات مع النمذجة الحركية، ويمكن قياس المعدلات المطلقة لتوليف مرناً والاضمحلال في مهدها الخميرة.
في إطار هذه المخطوطة، سنوضح كيفية السماح تحليل للحمض النووي الريبي يدون حديثا للكشف عن دور عالمي لمجمعات كواكتيفاتور الملحمة وتفييد في الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ في مهدها الخميرة1514،، 16. الأهم من ذلك، تحدد مستويات مرناً مستقرة في S. cerevisiae الدراسات السابقة واقترح أن الملحمة يلعب دالة الغالبة على مجموعة محدودة من جينات الخميرة التي تتأثر بشدة بالطفرات في الملحمة ولكن مقاومة نسبيا تفييد الطفرات17،،من1819. من المستغرب، عرضت الأنشطة الانزيمية الملحمة العمل بشأن الجينوم كله يدون، مما يشير إلى دور أوسع لهذا المنشط المشارك في الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ. وقد لوحظ تناقص الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني التعيين في الجينات أعرب معظم لدى المنظمة من الملحمة أو تفييد، مما يوحي بأن هذه كواكتيفاتورس العمل معا في معظم الجينات. ومن ثم، التحديد الكمي مرناً يدون حديثا كشفت أن الملحمة وتفيد المطلوبة للنسخ لما يقرب من جميع الجينات بالحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني14،،من1516. تنفيذ آليات تعويضية لتبرز بوصفها وسيلة للخلايا للتعامل مع انخفاض عالمي في توليف مرناً التي يتم تخزينها مؤقتاً نقصان عالمية متزامنة في تدهور مرناً. الملحمة ويضيف إلى قائمة العوامل وجود تأثير عالمي على الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ، مثل الحمض النووي الريبي بول الثاني مفارز10، مجمع كواكتيفاتور20الوسيط، العام النسخ عامل تفييه21،22 ، والعناصر غير مباشر، مرناً تدهور الآلية9،10،23. مثل هذه الأحداث التعويضية لوحظت عالمياً في ساغا المسوخ، والمحاسبة للتغييرات المتواضعة والمحدودة في مستويات مرناً مستقرة رغم انخفاض عالمي وشديدة في توليف مرناً14. كما أجريت التحاليل مماثلة في سلالة حذف BRE1 ، أدى إلى خسارة كاملة من هستون H2B أوبيكويتينيشن. من المثير للاهتمام، يمكن الكشف عن كثير أكثر اعتدالا ولكن يتفق تأثير عالمي على الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ في غياب Bre1، مشيراً إلى أن وسم الأيضية للجيش الملكي النيبالي يدون حديثا في الخميرة يمكن الكشف والتحديد الكمي لمجموعة واسعة من التغييرات في مرناً معدلات التوليف.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين لا تزال هي تحسين الأدوات على نطاق الجينوم لتحليل التغيرات في النسخ، التحليل الوحيد من الترنسكربيتوم عن طريق التحديد الكمي لمستويات مستقرة من الحمض النووي الريبي قد لا تعكس التغييرات في الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النشاط. وفي الواقع، ينظم مستويات مرناً ليس فقط بتوليف الحم…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر لازلو طرة على دعمه وخامساً فيشر وشوماخر ك. ف. ش سافين لمناقشاتهم. وأيده يد زمالة ماري كوري-أي تي (بيتن-GA-2013-606806، NR-نت) و “مؤسسة قوس”. وأيد هذا العمل الأموال من الوكالة الوطنية للبحث (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). وأيد هذه الدراسة أيضا ANR-10-لابكس-0030-إينرت، صندوق الدولة الفرنسية تديره الوكالة الوطنية للبحث تحت دعفينير يشرف البرنامج الإطار ANR-10-معرض أيدكس-0002-02.
Materials
| 4-Thiouracil | Sigma-Aldrich | Cat# 440736 | |
| Rapamycin | Euromedex | Cat# SYN-1185 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher | N/A | |
| RiboPure RNA Purification kit, yeast | ThermoFisher | Cat# AM1926 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | |
| EZ-Link HPDP Biotin | ThermoFisher | Cat# 21341 | |
| Thiolutin | Abcam | ab143556 | |
| µMACS Streptavidin kit | Miltenyi Biotec | Cat# 130-074-101 | |
| Transcriptor Reverse Transcriptase | Roche | 03 531 295 001 | |
| SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| GeneChip Yeast Genome 2.0 | ThermoFisher | 900555 | |
| GeneChip Fluidics Station 450 | ThermoFisher | 00-0079 | |
| GeneChip Scanner 3000 7G | ThermoFisher | 00-0210 |
References
- Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
- Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
- Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , 11-17 (2012).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
- Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
- Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
- Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
- Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
- Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
- Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
- Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).
- Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
- Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
- Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
- Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
- Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
- Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
- Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
- Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
- Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
- Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
- Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
- Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741 (2017).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
- Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
- Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822 (2013).
- Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
- Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
- Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
- Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
- Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
- Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
- Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
- Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
- Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).
