酿酒酵母4-硫尿嘧啶代谢标记及新合成 mRNA 作为 RNA 聚合酶 II. 活性的一种代理
Summary
这里描述的协议是基于全基因组的定量的新合成的 mRNA 纯化的酵母细胞标记为 4-硫尿嘧啶。这种方法允许测量 mrna 合成与 mrna 衰变分离, 从而提供了 RNA 聚合酶 II 转录的精确测量。
Abstract
转录组研究稳态 rna 可能忽略 rna 聚合酶 II 转录的全球缺陷。事实上, mrna 合成的全球减少被证明是通过同时减少 mrna 退化来恢复正常的稳态水平而得到补偿的。因此, 全基因组定量的 mrna 合成, 独立于 mrna 衰变, 是 RNA 聚合酶 II 转录活性的最佳直接反映。在这里, 我们讨论了一种使用非扰动代谢标记的新的 rna 在酿酒酵母(酵母) 的方法。具体来说, 细胞培养6分钟与尿嘧啶模拟, 4-硫尿嘧啶, 和标记的新转录 rna 被纯化和量化, 以确定所有个体 mRNA 的合成率。此外, 使用标记粟粟细胞作为内部标准允许比较不同的酵母菌株的 mRNA 合成。利用该协议和动态动力学模型拟合数据, 可以确定相应的 mRNA 衰减率。
Introduction
细胞通过基因表达程序的动态改变对内源和外源性线索作出反应。近年来, 全基因组方法的巨大发展允许在不同的条件下对转录的准确和全面的描述。在大多数转录组研究中, 微阵列杂交或高通量测序用于从总稳态 rna 分数中量化 rna 水平。在特定的摄动下转录改变可以显示出广泛的可能的结果, 与特定基因表达变化或大范围的基因要么上升或下调。基因表达是由 rna 聚合酶和影响 rna 水平的其他过程的 rna 合成之间的微调平衡或稳态的结果。RNA 聚合酶 II 转录, 包括其三不同的阶段 (起始, 伸长, 和终止), 是高度和错综复杂的与 mRNA 处理, 细胞质出口, 翻译和降解相关。
最近的一些研究表明, mRNAs 合成和衰变是耦合机制, 并表明在量化总稳态 RNA 时, 可以忽略对突变或刺激下的转录效应。首先, 通过对 mRNA 稳态水平的分析, 对转录变化的检测始终取决于 mRNAs 半衰期。一旦引入扰动, 长期半衰期的 mRNAs 的稳态水平将比短半衰期 mRNAs 的影响要小得多。因此, RNA 合成变化的可检测性强烈偏向于短寿命转录, 而较长存活的 mRNA 种类的分析可能无法揭示转录速率的动态变化。其次, 一些报告表明, 在酵母和哺乳动物中, 在分析 mRNA 的稳态水平时, 可能会忽略转录的全球变化。这可能是由于链路 mrna 合成和退化导致 mrna 缓冲的机制。这促使开发新的协议, 以量化 mrna 合成与降解分离, 通过对新转录 mrna 的分析。近年来, 提出了几种替代方案, 包括全球运行时序 (GRO)1和本机伸长率转录序列 (NET seq)2、3。在这里, 我们提出的协议最初开发的哺乳动物细胞4,5,6 , 然后适应酵母7,8,9,10, 11, 这是基于 RNA 标记与巯基核苷或基础模拟, 4-thiouridine (4sU) 或 4-硫尿嘧啶 (4tU), 分别。
这种方法专门净化新转录的 rna 从细胞的 rna 是脉冲标记与4sU 几乎没有干扰细胞稳态。因此, 一旦细胞暴露在 4sU, 分子迅速小白菜植株吸, 磷酸化到4苏三磷酸盐, 并纳入 rna 被转录。一旦脉冲标记, 它是可能提取总细胞 rna (对应于稳定状态的 rna), 并随后, 4 su 标记的 rna 分数是硫醇-特别修改, 导致生物素之间的二硫键的形成和新转录的 RNA4,5。然而, 4sU 只能由表达核苷转运体的细胞小白菜植株吸, 如人类要核苷转运 (hENT1), 防止其立即在萌芽或裂变酵母中使用。虽然可以在粟或s. 酵母中表达 hENT1, 但使用改良的碱4tU 可以实现更简便的方法, 因为酵母细胞可以占用 4tU, 而不需要核苷转运体10的表达,11,12,13. 事实上, 4tU 的新陈代谢需要酶尿嘧啶核糖 (UPRT) 的活性。在几个有机体, 包括酵母, 但不是哺乳动物, UPRT 是一个嘧啶打捞途径, 回收尿嘧啶尿苷单磷酸的关键。
转录组研究中的一个重要偏差可以通过平行分析的不同样本之间的规范化来引入。事实上, 许多偏离因素可能影响突变体和野生型菌株转录组的比较分析: 细胞裂解的效率、RNA 提取和恢复的差异, 以及用于微阵列分析的扫描器校准差异, 等等。如上所述, 当预期全球对 RNA 聚合酶 II 转录产生影响时, 这种变化会特别误导人。以远亲相关裂变酵母粟粟为内部标准, 设计了一种精确比较不同样品间 mRNA 合成速率的优雅的平均值。为此, 在细胞裂解和 RNA 提取之前, 将固定数量的标记的粟细胞添加到s. 酵母样本中, 即野生型或突变细胞.随后,粟和s 酵母的稳态和新合成的 rna 可以通过 rt-pcr 或通过微阵列芯片或高通量测序10进行量化。将这些数据与动力学建模相结合, 可以测量发芽酵母中 mRNA 合成和衰变的绝对速率。
在本手稿的框架中, 我们将展示新转录 rna 的分析如何能够揭示辅激活因子配合物佐贺和 TFIID 在萌芽酵母14,15, rna 聚合酶 II 转录中的全球作用, 16。重要的是, 过去的研究量化了S 酵母的稳态 mRNA 水平, 并建议佐贺在有限的酵母基因上发挥主导作用, 这一组受佐贺突变的强烈影响, 但相对抗 TFIID突变17,18,19。令人惊讶的是, 佐贺酶活性被证明对整个转录基因组起作用, 这表明在 RNA 聚合酶 II 转录中这一共同激活剂的作用更广泛。减少 RNA 聚合酶 II 在大多数表达基因的招募在佐贺或 TFIID 的灭活时观察到, 表明这些辅活化因子在大多数基因一起工作。因此, 新转录 mRNA 的定量显示, 佐贺和 TFIID 是需要的转录几乎所有基因的 RNA 聚合酶 II14,15,16。补偿机制的实施成为一种方法, 使细胞能够应对全球 mrna 合成减少, 这是由于 mrna 退化同时全球减少而缓冲的。佐贺添加了全球影响 rna 聚合酶 ii 转录的因素列表, 如 rna Pol ii 亚基10、调解人辅激活因子复合20、一般转录因子 TFIIH21、22和间接地, mRNA 降解机械的元素9,10,23。这种补偿性事件在佐贺突变体中普遍可见, 尽管 mrna 合成14的全球和严重减少, 但稳定状态 mRNA 水平的变化不大且有限。类似的分析也进行了BRE1删除应变, 导致完全丧失组蛋白 H2B 泛素化。有趣的是, 在缺乏 Bre1 的情况下, 可以检测到 rna 聚合酶 II 转录的温和但一致的全球影响, 这表明在酵母中新转录的 rna 的代谢标记可以检测和量化 mRNA 的广泛变化范围。合成率。
Protocol
Representative Results
Discussion
虽然基因组范围的工具来分析转录的变化仍在改善, 但通过定量的 rna 的稳态水平的定量分析对转录的分析可能无法准确地反映 rna 聚合酶 II 活性的变化。事实上, mRNA 水平不仅受 RNA 合成的调控, 而且还受其成熟和降解的制约。为了测量 mrna 合成与 mrna 降解的不耦合性, 近年来开发出了不同的实验方法, 用于分析酵母和哺乳动物中的新生转录。
对新生转录进行定量的最广泛使用?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢他的支持和诉费舍尔, k. 舒马赫和 f. El Saafin 的讨论。肺结核由 ITN (PITN-GA-2013-606806, NR) 和基金会 ARC 支持。这项工作得到了法新社谜 (ANR-15-CE11-0022 SAGA2) 的资金支持。这项研究也得到了 ANR-10-LABX-0030-INRT 的支持, 法国国家基金是由法新社谜在审批 d ‘ 艾文莉 ANR-10-IDEX-0002-02 框架计划下管理的。
Materials
| 4-Thiouracil | Sigma-Aldrich | Cat# 440736 | |
| Rapamycin | Euromedex | Cat# SYN-1185 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher | N/A | |
| RiboPure RNA Purification kit, yeast | ThermoFisher | Cat# AM1926 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | |
| EZ-Link HPDP Biotin | ThermoFisher | Cat# 21341 | |
| Thiolutin | Abcam | ab143556 | |
| µMACS Streptavidin kit | Miltenyi Biotec | Cat# 130-074-101 | |
| Transcriptor Reverse Transcriptase | Roche | 03 531 295 001 | |
| SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| GeneChip Yeast Genome 2.0 | ThermoFisher | 900555 | |
| GeneChip Fluidics Station 450 | ThermoFisher | 00-0079 | |
| GeneChip Scanner 3000 7G | ThermoFisher | 00-0210 |
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