酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして
Summary
ここで説明されているプロトコルは、4-チオウラシルが付いた酵母から精製した新しく合成された mRNA のゲノムワイドな定量化に基づいています。このメソッドは、mrna から非 mRNA 合成を測定することができ、したがって、RNA のポリメラーゼ II のトランスクリプションの正確な測定を提供します。
Abstract
RNA ポリメラーゼ II の転写で世界的な欠陥は、トランスクリプトーム研究は、定常状態の RNA を分析によって見落されるかもしれない。確かに、mRNA 合成の世界的な減少は通常定常状態レベルを復元する mRNA 分解の同時減少で補償されるように示されています。したがって、mrna から独立して、mRNA が合成のゲノムワイドな定量化は RNA ポリメラーゼ II の転写活性の最高の直接の反射です。ここでは、酵母(出芽酵母) における初期の rna 代謝ラベリングの非摂動法について述べる。具体的には、ウラシル、アナログ 4-チオウラシルと 6 分のため培養されるセルとラベル新しく転写された Rna の精製しすべての個々 の mRNA の合成レートを決定する定量化します。さらに、内部標準により異なる酵母mRNA 合成の比較として分裂酵母細胞のラベルを使用して系統。このプロトコルを使用して、継ぎ手の動的な運動モデルとデータは、対応する mRNA の腐食率を決定できます。
Introduction
セルは、内因性と外因性手がかり、その遺伝子発現プログラムの動的変化に対応します。近年、ゲノム手法の途方もない開発は、さまざまな条件でトランスクリプトーム変更に関する正確な包括的な記述をことができます。ほとんどのトランスクリプトーム研究でマイクロ アレイ交配または高スループット シーケンスは合計定常 RNA 画分からの RNA レベルの定量化に使用されます。転写の変更特定の摂動の下では、特定の遺伝子の表現の変更やアップまたはダウンレギュ レート遺伝子の大きいスペクトルの可能な結果の広い範囲を表示できます。遺伝子発現調整の平衡の結果である- または定常状態-RNA ポリメラーゼが RNA 合成と RNA のレベルに影響を与える他のプロセスの間。Rna ポリメラーゼ II の転写は高度および複雑な mRNA や劣化、翻訳、細胞質のエクスポート処理に関連付けられているが (開始、延長および終了) の 3 つの段階を含みます。
いくつかの最近の研究は Mrna 合成と崩壊結合メカニズムが、とき定常状態の総 RNA 転写効果突然変異または刺激を見落とすことができる示した。まず、常に mRNA の定常状態レベルの分析を通して転写変化の検出は、Mrna の半減期に依存します。摂動を導入すると、短い半減期を持つ Mrna のそれらより長い半減期を持つ Mrna の定常状態レベルにはるかに少ない影響します。したがって、RNA 合成の変化の検出能転写率のダイナミックな変化を明らかにする長寿命の mRNA 種の解析が失敗する中短時間の成績証明書を支持してバイアス強くされています。第二に、いくつかのレポートは、酵母や哺乳類の両方で、転写でグローバルな変更は見落されるかもしれない mRNA の定常状態レベルを解析するとき示されています。これは mRNA 合成と分解の mRNA のバッファリングの結果をリンク機構による可能性が高いです。これは新たに転写された mRNA の解析による劣化から非 mRNA 合成を定量化する新しいプロトコルの開発を促した。近年、グローバル実行シーケンス (GRO seq)1、配列 (NET seq)2,3ネイティブ伸長トラン スクリプトなど、いくつかの選択肢が提示されています。ここで、当初哺乳類セル4,5,6で開発され、酵母7,8,9,10に適応し、プロトコルを紹介して 11, RNA のチオール ヌクレオシドまたは基本アナログで分類に基づく 4-thiouridine (4sU) または 4-チオウラシル (4tU)、それぞれ。
このメソッド具体的には浄化する RNA の細胞から新しく転写 RNA が細胞の恒常性の干渉のほとんどない、4sU 付けパルス。したがって、セルは、4sU にさらされれば、一度、分子は急速に有った、4sU 三リン酸にリン酸化し、転写される Rna に組み込まれているです。(RNA の定常状態レベルに対応する)、総細胞 RNA を抽出することが可能だし、その後、4sU 標識 RNA の一部分はチオール具体的に、パルス標識を変更した後、ビオチン間のジスルフィド結合の形成につながると新しく転写 RNA4,5。ただし、4sU は人間の平衡ヌクレオシド輸送体 (hENT1)、出芽か分裂酵母で、すぐに使用を防止するよう、ヌクレオシド輸送体の発現している細胞によって取り込まれたをできるだけです。酵母は、ヌクレオシドの運送者10,の式を必要とせず、4tU を取ることができるので変更された基本 4tU を使用してより簡単なアプローチを実現できますs.pombeの出芽酵母hENT1 で表現できる 1 つ間11,12,13。 実際には、4tU の代謝は酵素ウラシル phosphoribosyltransferase (UPRT) の活動を必要とします。酵母がない哺乳類を含むいくつかの生物では、UPRT はウリジル酸にウラシルをリサイクル ピリミジンの海難救助の細道に不可欠です。
並行分析の異なるサンプル間の正規化でトランスクリプトーム研究に重要なバイアスを導入できます。確かに、多くの逸脱要因を及ぼします変異体と野生型株のトランスクリプトームの比較分析: セル換散の効率の抽出と RNA およびマイクロ アレイ解析用スキャナーの調整で差異の回復の違い、他の中で。前述したように、RNA ポリメラーゼ II の転写で世界的な効果が期待されるときそのような変化は特に誤解を招くできます。異なるサンプル間の mRNA 合成率を正確に比較するエレガントな意味は、内部標準として遠縁分裂酵母分裂酵母を使用してによって設計されました。そのため一定数のラベル, 分裂酵母出芽酵母のサンプルは、野生型や突然変異細胞、セル換散および RNA 抽出10前にセルが追加されます。その後、 , 分裂酵母と酵母から定常状態と新たに合成された Rna は RT qPCR または経由でマイクロ アレイ チップまたは高スループット シーケンス10の使用によって明らかにした.速度論的モデリングとこれらのデータを組み合わせて、mRNA 合成と出芽酵母における崩壊の絶対速度を測定できます。
この原稿のフレームワークでどの新たに転写された RNA の解析は新進の RNA ポリメラーゼ II の転写のコアクチベーター複合体佐賀と (ディスインテグリン) 酵母14,15のためにグローバル ロールを明らかにするため許可されて表示されます。 16。重要なは、過去の研究は出芽酵母の定常状態の mRNA のレベルを定量化し、佐賀が佐賀で突然変異によって強く影響を受けるが (ディスインテグリン) に比較的耐性酵母遺伝子の限定セットに支配的な機能を果たしていることが示唆されました。突然変異17,18,19。驚いたことに、佐賀酵素は RNA ポリメラーゼ II の転写でこの co 活性剤のより広範な役割を示唆して、全く転写ゲノムに関する法律に示されていた。減少で最も発現遺伝子の RNA ポリメラーゼ II 新卒を募集していた佐賀またはこれらし、コアクチベーターがほとんど遺伝子で一緒に仕事することを示唆している (ディスインテグリン) の不活化に.したがって、新たに転写された mRNA の定量化は、佐賀と (ディスインテグリン) が RNA ポリメラーゼ II14,15,16でほぼすべての遺伝子の転写に必要なことを明らかにしました。代償機構の実装は、細胞 mRNA 分解同時グローバル減少によってバッファリングは mRNA 合成の世界的な減少に対処するための方法として現れます。転写因子 tfiih が不安定21,22 一般、調停コアクチベーター複合20RNA ポリメラーゼ II の転写、RNA Pol II サブユニット10など全体に影響を及ぼす因子のリストに追加します佐賀と間接的に、mRNA 分解機械9,10,23の要素。そのような代償的なイベントは佐賀変異体の mRNA 合成14のグローバルかつ深刻な減少にもかかわらず定常状態の mRNA のレベルのささやかな、限られた変更を会計で普遍的に観察されました。同様の分析は、ヒストン H2B のユビキチン化の完全な損失の結果BRE1の削除のひずみで行われました。酵母の新規転写された RNA の代謝ラベリングすることができます検出し、mRNA の変化の広い範囲を定量化することを示す、Bre1 の不在で、穏やかな、一貫したグローバルに大きな影響 RNA ポリメラーゼ II の転写を検出できる興味深いことに、合成料金です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゲノムワイドな転写の変化を解析するツールまだ改善している間唯一 RNA の定常状態レベルの定量化によるトランスクリプトーム解析では RNA ポリメラーゼ II の活性の変更は正確に反映可能性があります。確かに、mrna は RNA 合成だけでなく、成熟し、劣化も規制されています。MRNA 分解から非 mRNA 合成を測定するには、明確なプロトコルは、酵母や哺乳類の初期転写の解析のため近年開発さ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
彼のサポートのためのラズロ寅と V. フィッシャー、k. シューマッハと f. エル Saafin 議論のために感謝しますマリー キュリー ITN フェローシップ (PITN-ジョージア州-2013-606806、NR ネット) に支えられ闘病を続けてと財団アーク。この作品は、アジャンス ナシオナル デ ラ抜き (ANR-15-CE11-0022 SAGA2) からの資金によって支えられました。本研究は、ANR-10-LABX-0030-INRT、フレーム プログラム Investissements d’Avenir ANR-10-アイデックス-0002-02 下のアジャンス ナシオナル デ ラ抜きの運営するフランス国家ファンドによっても支えられました。
Materials
| 4-Thiouracil | Sigma-Aldrich | Cat# 440736 | |
| Rapamycin | Euromedex | Cat# SYN-1185 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher | N/A | |
| RiboPure RNA Purification kit, yeast | ThermoFisher | Cat# AM1926 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | |
| EZ-Link HPDP Biotin | ThermoFisher | Cat# 21341 | |
| Thiolutin | Abcam | ab143556 | |
| µMACS Streptavidin kit | Miltenyi Biotec | Cat# 130-074-101 | |
| Transcriptor Reverse Transcriptase | Roche | 03 531 295 001 | |
| SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| GeneChip Yeast Genome 2.0 | ThermoFisher | 900555 | |
| GeneChip Fluidics Station 450 | ThermoFisher | 00-0079 | |
| GeneChip Scanner 3000 7G | ThermoFisher | 00-0210 |
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