Summary
Vi beskriver en metode for isolering av endokrine celler fra embryonale, neonatal og postnatal pancreases etterfulgt av encellede RNA sekvensering. Denne metoden kan analyser av bukspyttkjertelen endokrine avstamning utvikling, celle heterogenitet og transcriptomic dynamics.
Abstract
Bukspyttkjertelen endokrine celler som er gruppert i holmer, regulerer blod glukose stabilitet og energi metabolisme. De ulike celletyper i øyer, inkludert insulin sekresjon β celler, er differensiert fra vanlige endokrine progenitors under embryonale scenen. Umodne endokrine celler utvide via celle spredning og modne under en lang utviklingsmessige barseltiden. Imidlertid er mekanismene bak disse prosessene ikke klart definert. Encellede RNA-sekvensering er en lovende metode for karakterisering av ulike celle populasjoner og sporing celle avstamning differensiering trasé. Her beskriver vi en metode for den encellede RNA-sekvensering av isolerte bukspyttkjertelen β celler fra embryonale, neonatal og postnatal pancreases.
Introduction
Bukspyttkjertelen er et viktig metabolsk organ i pattedyr. Bukspyttkjertelen består av endokrine og exocrine avdelinger. Bukspyttkjertelen endokrine cellene, inkludert insulin-produserende β celler og produserer glukagon α celler, klynge sammen i holmer Langerhans og regulere coordinately systemisk glukose homeostase. Dysfunksjon endokrine cellene fører til diabetes mellitus, som har blitt et stort folkehelseproblem over hele verden.
Bukspyttkjertelen endokrine celler er avledet fra Ngn3+ progenitors under embryogenesis1. Senere, i perinatalperioden sprer endokrine cellene til skjemaet umodne holmer. Disse umodne celler fortsette å utvikle og gradvis bli moden holmer, som blir rikt Stangeriaceae for å regulere blod glukose homeostase i voksne2.
Selv om en gruppe transcriptional faktorer er identifisert som regulerer β celledifferensiering, er presis modning veien β celler fortsatt uklart. Videre omfatter β celle modning prosessen også regulering av celle nummer ekspansjon3,4 og generering av mobilnettet heterogenitet5,6. Imidlertid har regulatoriske mekanismer av disse prosessene ikke vært godt undersøkt.
Encellede RNA-sekvensering er en kraftig tilnærming kan profil celle subpopulasjoner og spore celle avstamning utviklingsmessige trasé7. Utnytter denne teknologien, nøkkelen hendelser som oppstår under bukspyttkjertelen Holme utvikling kan tyde på encellede nivå8. Blant encellede RNA-sekvensering protokollene tillater Smart-seq2 generering av full lengde cDNA med økt følsomhet og nøyaktighet, og bruk av standard reagenser lavere kostnader9. Smart-seq2 tar ca to dager å konstruere et cDNA bibliotek for sekvensering10.
Her foreslår vi en metode for isolering av fluorescens-merket β celler fra pancreases av fetal voksen Ins1-RFP transgene mus11, bruke fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS), og ytelsen til transcriptomic analyserer på den encellede nivå, ved hjelp av Smart-seq2 teknologi (figur 1). Denne protokollen kan utvides for å analysere transcriptomes alle bukspyttkjertelen endokrine celletyper i normal, patologiske og aldring stater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Pekinguniversitetet.
1. bukspyttkjertelen isolasjon
-
For E17.5 (embryonale dag 17,5) embryo:
- Anslå embryonale dag 0,5 basert på tidspunktet når vaginal pluggen vises.
- Ofre gravid musene av CO2 . Spray abdominal pelsen med 70% alkohol.
- Gjør en V-formet snitt med saks fra underlivet utvide til ribbeina. Denne prosessen åpne helt bukhulen.
- Dissekere livmor av bukhulen og plasserer den i en 10 cm tallerken med kaldt PBS.
- Dissekere embryoer fra livmoren med tynn-tipped tang under en stereomicroscope, fjerne andre vev, som morkaken og navlestreng. Sett alle embryoer i en 10 cm tallerken med kaldt PBS.
- Rive åpne embryo bukhulen og grave ut visceral vevet med albuen pinsett. Overføre visceral vevet i en 6 cm svart bunn tallerken med kaldt PBS.
- Bukspyttkjertelen ligger i øvre venstre del av magen og legger de mage, milt og duodenum (gul prikket linje i figur 2A)12. Koble fra pancreases fra visceral vev ved hjelp av pinsett og bassenget bukspyttkjertelen vevet sammen i en 20 mL flaske inneholder 5 mL 0,5 mg/mL kaldt collagenase løsning: 0,5 mg/mL collagenase P i isolasjon buffer (HBSS med 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2 5 mM glukose, pH 7.4).
-
For P0-P15 (postnatal dag 0-15) mus:
- Ofre og fastsette musen ved å følge leddene for et stykke Borstemmaskin protector med tape. Spray abdominal pelsen med 70% alkohol.
- Helt åpne bukhulen som beskrevet i trinn 1.1.3. Trekk tarmen ut og på venstre side av musen. Denne fremgangsmåten vil utsette duodenalsår, mage og splenic lobes av bukspyttkjertelen. Nøye analysere alle fliker av bukspyttkjertelen (figur 2B)12 og bassenget bukspyttkjertelen vevet sammen i en 20 mL flaske inneholder 5 mL 0,5 mg/mL kaldt collagenase løsning.
-
For P18-P60 (postnatal dag 18-60) mus:
- Forberede collagenase løsningen. Hold på is inntil klar til bruk.
- Ofre musen og åpne bukhulen som nevnt ovenfor (trinn 1.1.2 og 1.1.3).
Merk: Vondt ikke leveren, noen sår til leveren vil redusere flyten presset inn i gallekanalen og redusere perfusjon effektiviteten i følgende trinn. - Fjerne xiphoid. Trekk tarmen ut og høyre side av musen, og skyve venstre og rett mediale lobes av leveren til hver side å avsløre galleblæren (hvit pil i figur 2C) og felles galle duct.
- Klemme tolvfingertarmen med et par små fartøy klemmer på øvre og nedre posisjon, flankert området der galle duct inn tolvfingertarmen (figur 2D).
Merk: Ikke klemme mage eller splenic lobes av bukspyttkjertelen. Collagenase løsningen vil ikke strømme inn i mage og splenic flik av bukspyttkjertelen i neste trinn hvis festet. - Fyll en sprøyte med 5 mL 0,5 mg/mL kaldt collagenase og sette inn en 30 G nål i galleblæren. Nøye og jevnt, manipulere nålen gjennom felles galle duct.
- Perfuse bukspyttkjertelen ved å injisere 1 – 5 mL 0,5 mg/mL kaldt collagenase løsning, avhengig av musen. Injeksjon bør være treg og konstant å hindre nålen sklir ut av røret og hindre at tarmen sprengning under høytrykk flytende. Injeksjon er fullført når bukspyttkjertelen er fullstendig utvidet.
- Dissekere bukspyttkjertelen (gul stiplede linjen i figur 2D) av bukhulen ved hjelp av pinsett umiddelbart etter perfusjon. Plass vevet i 20 mL ampuller som inneholder 5 mL 0,5 mg/mL kaldt collagenase løsning. Hvis manipulerer flere musen samtidig, perfuse mus enkeltvis og basseng vev i kalde collagenase løsning i ampuller 20 mL til alle mus har blitt dissekert.
2. collagenase fordøyelsen og Holme isolasjon
- Plasser 20 mL ampullen inneholder bukspyttkjertelen vevet i et 37 ° C vannbad og ruge for 3 min til equilibrate temperatur.
- Forsiktig risting røret for en annen 3 til 5 min. Hvis bukspyttkjertelen vevet er fullt ut oppblåst, vil det gradvis distansere i liten vev biter før det er endelig spres jevnt. Fordøyelsen tiden varierer avhengig av bukspyttkjertelen størrelsen og perfusjon effektiviteten.
- Filtrere fordøyd produktet gjennom en 0,25 mm nylon sil i en ny 50 mL sentrifuge tube. Grundig vask silen med en 20 mL sprøyte som inneholder iskald PBS.
- For E17.5-P15 pancreases, hopper du til trinn 3.1.
- P18-P60 pancreases, sentrifuge 200 x g for 1 min og forkaste nedbryting. Nytt suspendere vevet med kaldt PBS.
- Hell 5 mL av vev suspensjon i en 6 cm sort-bunnen rett. Bukspyttkjertelen øyene er liten, kompakt, melkeaktig hvit strukturer acinar vev er løs og gjennomskinnelig hvitt. Velg holmer med en 200 μL pipette og overføre dem til en 1,5 mL rør som inneholder en liten mengde kaldt PBS.
3. trypsin fordøyelsen av bukspyttkjertelen vev eller holmer
- Sentrifuge røret som inneholder bukspyttkjertelen vev eller holmer 200 x g for 1 min på 4 ° C og kast nedbryting uten å forstyrre pellet.
- Nytt utsette pellets med 0,25% trypsin-EDTA og ruge i et 37 ° C vannbad. Etter 4 min med inkubering, forsiktig og noen ganger sug du opp (pipette) for 1 min bruker 200 μL tips.
Merk: For E17.5-P3 pancreases, legge 1 mL trypsin-EDTA. P4-P15 pancreases, legge 3 mL trypsin-EDTA. 100-300 holmer, legge 1 mL trypsin-EDTA. Justere volumet på trypsin-EDTA etter mengden vev. - Stoppe fordøyelsen ved legge 0,4 x antall kalde fosterets bovin serum (FBS) og bland med mild vortex.
- Sentrifuger 250 x g i 3 minutter på 4 ° C. Kast nedbryting uten å forstyrre pellet.
- Nytt suspendere cellene med 200 μL kaldt FACS buffer (HBSS 1 prosent FBS, pH 7.4). Overføre celler slik 5 mL FACS.
- Raskt spinne FACS røret slik at celle suspensjon passerer gjennom filteret for å fjerne ufordøyd store vev rusk. Enkelt celle suspensjon i røret er nå klar for FACS sortering.
4. encellede Lysis
-
Forberede celle lyseringsbuffer.
Merk: Utføre alle eksperimentene under UV-steriliseres hette med laminær strømning. Alle rør, plater og pipette-spisser bør være RNase- / DNase-free. Dekontaminere panseret og Pipetter RNase bort løsning før bruk.- Tine reagensene på is: dNTP (10 mM) og oligo-dT primer (10 μM) ERCC lagerløsning (1:20).
- Fortynn ERCC 1:5 x 105 med nuclease-fritt vann.
- Beregne volumet av cellen lyseringsbuffer nødvendig. Legge til 0,1 μL RNase hemmer (40 U/μL), 1,9 μL 0,2% (vol/vol) Triton X-100, 1 μL dNTP, 1 μL oligo-dT primer og 0,05 μL utvannet ERCC til et endelig antall 4.05 μL for hver celle.
- Aliquot lyseringsbuffer celle i 0,2 mL tynne vegger 8-stripe PCR rør eller 96-brønns plater. Sentrifuge rør eller plater for 30 s på 4 ° C.
Merk: Sentrifuge 0,2 mL tynne vegger 8-stripe PCR rør på 7500 x g og 96-brønns plater på 800 x g i fremgangsmåten.
-
Encellede plukking og lyse.
- Manuelt velge FACS sortert Ins1-RFP+ enkeltceller i FACS buffer i 8-stripen PCR rør med en 30-40 µm kapillær pipette, eller direkte sortere Ins1-RFP+ enkeltceller i 96-brønnen platene. Volumet som inneholder en enkeltcelle anses å være mindre enn 0,3 μL.
Merk: Bruk frem scatter høyde (FSC-H) vs videresende scatter området (FSC-A) gating strategi for doublet diskriminering, FSC-H vs side scatter området (SSC-A) for rusk og fluorescens gating for sortering av Ins1-RFP+ -cellen (figur 3A-3C). For metoden plukking sortere målcellene i en 1,5 mL tube med 300 μL FACS buffer. Aktuelle siste konsentrasjonen er 5-10 celler/μL. Justere buffer volumet tilsvarende. Sortere en enkeltcelle i hver brønn av en 96-brønns plate etter manuell instrument for metoden plate samling. 7 , 13 - Vortex rør eller platene til lyse cellene og slipp RNA. Sentrifuge rør eller plater for 30 s 4 ° C og umiddelbart plassere dem på isen.
Merk: Cellene kan lagres ved-80 ° C i en uke.
- Manuelt velge FACS sortert Ins1-RFP+ enkeltceller i FACS buffer i 8-stripen PCR rør med en 30-40 µm kapillær pipette, eller direkte sortere Ins1-RFP+ enkeltceller i 96-brønnen platene. Volumet som inneholder en enkeltcelle anses å være mindre enn 0,3 μL.
5. encellede cDNA forsterkning
-
Omvendt transkripsjon (RT).
- Tine RT reagenser (tabell 1) på is.
- Ruge prøvene ved 72 ° C i 3 minutter og umiddelbart sette rør eller plater på isen i minst 1 kort sentrifuge rør eller plater for 30 s på 4 ° C.
Merk: Bruk en termisk cycler med 105 ° C oppvarmet lokk for alle incubations. - Klargjør RT blandingen for alle reaksjoner, som beskrevet i tabell 1.
- Dispensere 5.7 μL RT blanding til hver prøve å bringe volumet til totalt 10 μL. Forsiktig virvle blandingen og sentrifuge for 30 s på 4 ° C.
- Sett prøvene i en termisk cycler og start RT programmet som følger: 42 ° C i 90 min, 10 sykluser (50 ° C i 2 minutter, 42 ° C i 2 min), 70 ° C i 15 min og hold på 4 ° C.
-
PCR pre forsterkning.
- Tine PCR reagenser (tabell 2) på is.
- Klargjør PCR blandingen for alle reaksjoner, som beskrevet i tabell 2.
- Dispensere 15 μL PCR blanding til hver prøve, som inneholder den første-strand reaksjoner. Forsiktig virvle blandingen og sentrifuge for 30 s på 4 ° C.
- Sett prøvene i en termisk cycler og starte følgende PCR program: 98 ° C i 3 minutter, 18 sykluser (98 ° C for 20 s, 67 ° C i 15 s, 72 ° C i 6 min), 72 ° C i 5 min og hold på 4 ° C.
Merk: PCR produktet kan lagres ved 4 ° C i mindre enn en uke eller på 20 ° C/-80 ° C i opptil 6 måneder.
-
PCR rensing.
- Legg 25 μL re suspendert DNA rensing perler (1 x) til hvert utvalg fra forrige trinn og bland godt av vortex. Deretter raskt spinne rør eller plater ved romtemperatur å samle væske men unngå oppgjør av perler.
Merk: Equilibrate DNA rensing perler til romtemperatur for 15 min og vortex fullstendigt tidligere bruk. - Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
- Sted røret eller plate på en passende magnetiske stå til løsningen er klart, så nøye fjerne og kast nedbryting.
- Legge til 200 μL av nylagde 80% etanol å vaske perlene i magnetiske standen, ruge for 30 s, deretter forsiktig fjerne og slette etanol løsningen.
Merk: 80% (vol/vol) etanol løsningen skal være nylaget hver gang. - Gjenta trinn 5.3.4 totalt to vasker.
- Nøye fjerne og slette de gjenværende etanol løsningen og luft tørr perlene mens røret eller platen er på magnetiske stand.
Merk: Unngå over tørking perler for å sikre maksimal elueringsrør effektiviteten. - Legge til 11 μL nuclease-fritt vann elute DNA målet fra perler og bland godt vortex. Deretter raskt spinne rør eller plate og plassere den på en magnetisk stand inntil løsningen er klart. Overfør 10 μL prøven til en ny PCR-tube.
Merk: Hvis dimers finnes etter én enkelt runde med rensing, basert på cDNA størrelse distribusjon oppdagelse, rense igjen for å fjerne dimers helt. Dimers kan påvirke cDNA avkastningen beregningen hvis lov til å forbli i utvalget.
- Legg 25 μL re suspendert DNA rensing perler (1 x) til hvert utvalg fra forrige trinn og bland godt av vortex. Deretter raskt spinne rør eller plater ved romtemperatur å samle væske men unngå oppgjør av perler.
-
Kvalitetskontroll av cDNA.
- Tilfeldig prøver å oppdage cDNA totale avkastningen ved hjelp av en fluorometer.
- Evaluere markør genet uttrykk nivåene av sanntids PCR (qPCR) (figur 4E). Fjerne 1 μL prøve å fortynne 40 ganger og utføre qPCR ved hjelp av en 384-vel plate. Klargjør qPCR blandingen som beskrevet i tabell 3. Sykling forhold: 95 ° C i 10 min, 45 sykluser (95 ° C for 10 s, 60 ° C i 15 s, 72 ° C i 15 s).
- Tilfeldig prøver å oppdage størrelsesDistribusjon bruker en parallell kapillært geleelektroforese instrument.
6. cDNA biblioteket konstruksjon
-
Tagmentation reaksjon av Tn5 transposase.
- Oppdage den cDNA totale avkastningen qPCR valgt celler fra trinn 5.4.2 ved hjelp av en fluorometer. Bruk 2 ng av cDNA som utgangsmaterialet.
- Tine tagmentation reaksjon reagenser (Tabell 4) på is.
- Forberede tagmentation reaksjonen i en 0,2 mL tynne vegger 8-stripe PCR tube, som beskrevet i Tabell 4, og bland forsiktig av vortex. Deretter raskt spinne ned løsningen ved romtemperatur.
- Ruge prøvene ved 55 ° C i 10 min og holde på 4 ° C.
- Straks legge 2 μL 5 x TS hver utvalg som inneholder tagmented DNA å stoppe reaksjonen. Bland forsiktig av vortex, og deretter raskt spinne ned løsningen ved romtemperatur.
- Inkuber blandingen for 5 min ved romtemperatur. DNA skal behandles for den endelige anriking PCR umiddelbart.
-
Forsterkning av kort-samskrevet.
- Tine PCR reagenser (tabell 5) på is.
- Klargjør berikelse PCR blandingen, som beskrevet i tabell 5, og bland forsiktig av vortex. Deretter raskt spinne ned løsningen ved romtemperatur.
- Utføre PCR ved hjelp av følgende program: 72 ° C i 10 min, 98 ° C for 30 s, 8 sykluser (98 ° C i 15 s, 60 ° C for 30 s, 72 ° C i 3 minutter), 72 ° C i 5 min og hold på 4 ° C.
Merk: Antall sykluser, avhenger av hvor forventet biblioteket DNA.
-
PCR rensing med størrelse.
- Legg 14 μL re suspendert DNA rensing perler (0,7 x) til hvert utvalg fra forrige trinn og bland godt av vortex. Deretter raskt spinne røret ved romtemperatur å samle væske men unngå oppgjør av perler.
Merk: Equilibrate DNA rensing perler til romtemperatur for 15 min og vortex fullstendigt tidligere bruk. - Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
- Sett røret på en passende magnetiske stand inntil løsningen er klart, nøye overføre nedbryting til en ny stripe på røret og kast den forrige tube stripen.
- Tilsett 3 μL av nytt suspendert DNA rensing perler (0,15 x) til hvert utvalg i rør stripe og bland godt av vortex. Deretter raskt spinne røret ved romtemperatur.
- Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
- Sted røret eller plate på en passende magnetiske stå til løsningen er klart, så nøye fjerne og kast nedbryting.
- Legge til 200 μL av nylagde 80% etanol å vaske perlene i magnetiske standen, ruge for 30 s, deretter forsiktig fjerne og slette etanol løsningen.
Merk: 80% (vol/vol) etanol løsningen skal være nylaget hver gang. - Gjenta trinn 6.3.7 for totalt to vasker.
- Nøye fjerne og slette de gjenværende etanol løsningen og luft tørr perlene mens røret eller platen er på magnetiske stand.
Merk: Unngå over tørking perler for å sikre maksimal elueringsrør effektiviteten. - Legge til 11 μL nuclease-fritt vann elute DNA målet fra perler og bland godt vortex. Deretter raskt spinne rør eller plate og plassere den på en magnetisk stand inntil løsningen er klart. Overfør 10 μL prøven til en ny tube stripe.
- Legg 14 μL re suspendert DNA rensing perler (0,7 x) til hvert utvalg fra forrige trinn og bland godt av vortex. Deretter raskt spinne røret ved romtemperatur å samle væske men unngå oppgjør av perler.
-
Kvalitetskontroll av siste cDNA biblioteket.
- Måle konsentrasjonen av hvert bibliotek ved hjelp av en fluorometer og sjekk størrelsesDistribusjon bruker en parallell kapillært geleelektroforese instrument.
Merk: DNA avkastningen er vanligvis mellom 15-25 ng for hvert bibliotek. Fragmenter fra 250 bp til 450 bp vil bli observert. Hvis dimers forblir etter rensing, som bekreftes av størrelse distribusjon sjekken, rens med 1 x DNA rensing perler en gang.
- Måle konsentrasjonen av hvert bibliotek ved hjelp av en fluorometer og sjekk størrelsesDistribusjon bruker en parallell kapillært geleelektroforese instrument.
-
Biblioteket pooling
- Basert på omtrentlig fragment, basseng lik mengde DNA fra hver prøve, å sikre at ingen av dem inneholder de samme kombinasjonene av N6XX og N8XX.
7. DNA sekvensering
- Utsett barcoded biblioteker for 51 bp single-end sekvensering med en høy gjennomstrømming sekvensering system. Utføre den sekvensering etter produsentens protokoll. Sekvensering dybden i hver celle er ca 1 million leser i gjennomsnitt8, minst 0,5 millioner leser per celle14.
8. bioinformatikk analyser
-
Sekvensering kvalitet evaluering og justering.
- Vurdere kvaliteten på sekvensert leser FastQC (v0.11.3)15 med følgende parametere: "fastqc - ekstrakt -o output_dir input_fastq".
- Flette musen genomet med ERCC sekvenser ved hjelp av kommandoen "katten mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa".
- Bygge bowtie2 (v2.2.5)16 indeksen med følgende parametere: "bowtie2-bygge mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
- Justere leser bruker tophat2 (v2.1.0)17 med følgende parametere: "tophat2 -o output_dir -G gene.gtf - transcriptome-indeksen trans_index mm10_ERCC input_fastq".
-
Kvantifisere gene expression nivåer.
- Antall tilordnet leser for hver genet HTSeq (v 0.6.0)18 med følgende parametere: '' htseq-count - f bam r pos s ingen - en 30 accepted_hits.bam gene.gtf > read_count.txt''.
- Normalisere genet uttrykk nivåene til transkripsjoner per million (TPM)19.
-
Kvalitetskontroll av celler.
- Utelater celler med færre enn 0,5 millioner tilordnet leser eller færre enn 4 000 gener (TPM > 1).
Merk: kriteriet for utelukkelse avhenger av celletyper og sekvens dybde. - Beholde celler uttrykke endokrine markører (f.eks Ins1 for β celler, Gcg for α celler), og utelater celler som uttrykker ikke-endokrine markører (f.eks Spi1 for leukocytter).
- Utelater celler med færre enn 0,5 millioner tilordnet leser eller færre enn 4 000 gener (TPM > 1).
-
Viktigste komponenten analyse (PCA)
- Identifisere svært variabel gener ifølge ERCC pigg-ins, som beskrevet tidligere20.
- Utføre PCA funksjonen "PCA" i R pakke FactoMineR (v1.31.4)21, med log2(TPM + 0.1) av svært variabel gener.
- Visualisere PCA resultatene med ggplot2 (v2.0.0)22.
-
Hierarkisk klynger.
- Identifiser gener med de høyeste viktigste komponenten (PC) belastninger ved hjelp av funksjonen "dimdesc" FactoMineR (v1.31.4)21.
- Utføre hierarkisk klynger med funksjonen "heatmap.2" i det R-pakken gplots (v3.0.1)23, log2 (TPM + 1) relative verdier av høy PC lasting gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pancreases ble dissekert fra embryonale, neonatal og postnatal mus (figur 2A og 2B). For mus eldre enn postnatal dag 18 avhenger fordøyelseskanal effekten av graden av perfusjon; Derfor injeksjon er viktigste Holme isolering (figur 2C-2E og tabell 6). Så mye collagenase ble injisert som var mulig å fylle bukspyttkjertelen i dette trinnet. Fullt oppblåst bukspyttkjertelen er vist i figur 2D. Hvis perfusjonen er ikke vellykket (figur 2E), men prøven er dyrebare, kan bukspyttkjertel bli revet i små biter for tilstrekkelig fordøyelsen senere.
Etter perfusjon, ble bukspyttkjertelen vevet fordøyd i små biter å løslate holmer (figur 2F). Kortere FACS sortering tiden ved beriket vi endokrine cellene ved å plukke øyene på forhånd. Størrelsen på øyene kan variere etter fordøyelsen intensiteten og mus år. Noen ganger er øyene ikke runde i form. Holmer skal velges etter farge og kompakt tilstand (figur 2 g og tabell 6). Hvis belastningen transgene musen har en reporter genet, for eksempel GFP eller RFP for endokrine celler, kan øyene også plukkes under fluorescens mikroskop.
Ins1-RFP+ celler ble renset ved FACS sortering (figur 3A-3 C), og deretter enkeltceller ble plukket bruker en kapillær pipette for enkeltceller RNA-seq (figur 3D). Vellykket forsterket cDNA bør ha en full lengde over 500 bp og berikes fra 1,5 kb til 2 kb. Videre er det vanligvis en 500-600 bp anriking av cDNA i Ins1-RFP+ cellene, som kan representere insulin utskrifter (figur 4A). Men har det vært noen unormal situasjoner observert10 (tabell 6). For eksempel cDNA fragmenter nær 100 bp er primer dimers (figur 4B), som vanligvis skyldes overdreven primerne, som må fjernes ved å gjenta det DNA rensing trinnet. Eksistensen av primer dimers kan påvirke beregningene av totalt cDNA avkastning, som brukes for følgende biblioteket bygging. CDNA fragmenter mellom 100 bp og 500 bp vanligvis representerer degradert cDNA (figur 4C), som er forårsaket av dårlig celle status eller reagens problemer, for eksempel RNase forurensning. Under denne tilstanden, bør vi finne årsaken til DNA fornedrelse og ekskludere forstyrrelse. For eksempel, for å sikre god celle status, vev bør bli fordøyd og cellene skal sorteres raskt og forsiktig, og operasjoner skal utføres forsiktig for å unngå alle typer miljøgifter.
Etter rensing av cDNA bibliotekene for sekvensering fikk vi cDNA fragmenter av ulike størrelser ved å følge instruksjonene for å legge til ulike forhold av DNA rensing perler til prøven. For eksempel vi kan få cDNA fra 250 bp til 450 bp ved å legge til 0,7 x og 0,15 x DNA rensing perler til først og andre runden av rensing, henholdsvis (Figur 4 d). Dette trinnet har en høy suksessrate. Men hvis det er fragmenter av ca 100 bp, er det foreslått for å rense biblioteker igjen med 1 x DNA rensing perler fjerne dimers (tabell 6). Unremoved dimers vil forskyve DNA kvantifiseringen og vil påvirke prøven pooling resultater, som resulterer i den ujevne datainnsamling fra hver prøve.
Vi analyserte sekvensering dataene med bioinformatikk tilnærminger (figur 5A). Kvalitetspoengene sekvensering bør være større enn 30 under sekvensering kvalitet evaluering (figur 5B). Etter justering, er 80-90% av ventet til referanse genomet. For å oppnå høy kvalitet celler for nedstrøms analyser, vi utelukket celler med færre enn 0,5 millioner tilordnet leser eller med færre enn 4000 oppdaget gener (figur 5C og 5 D). Etter PCA og hierarkisk klynging, vi preget ulike grupper av celler og identifisert genene som ble heterogeneously uttrykt i forskjellige grupper8.
Figur 1: skjematisk oversikt for enkeltceller RNA-seq musen bukspyttkjertelen endokrine celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: bukspyttkjertelen disseksjon, perfusjon og Holme plukking. (A) Disseksjon av embryonale bukspyttkjertelen vev (lavere) fra et E17.5 embryo (øvre). Gul prikkelinje demarcates bukspyttkjertelen vevet. Skala bar = 1000 µm. (B) Disseksjon av postnatal bukspyttkjertelen (høyre) P10 mus (til venstre). Skala bar = 1000 µm. (C-D) bukspyttkjertelen vev av en P60 mus før (C) og etter (D) perfusjon. Gul prikkelinje demarcates bukspyttkjertelen vevet. Hvite pil viser galleblæren. (E) delvis perfused bukspyttkjertelen vevet P60 museklikk. Rød pil angir også perfused området i bukspyttkjertelen. Blå piler angir dårlig perfused områdene i bukspyttkjertelen. (F) i bukspyttkjertelen vev før (øverst) og etter (lavere) collagenase fordøyelsen. (G) piler peker til øyene som ble utgitt fra collagenase fordøyd bukspyttkjertelen vev. Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: manuelt velge celler med en 30-40 µm kapillær pipette under et mikroskop. (A-C) Step-Wise FACS gating sortering Ins1-RFP+ celler. (D) den lyse sirkler angir celler og røret er en kapillær pipette. Velg cellene med bedre morfologi (pil) og ignorere de grupperte cellene (pilspiss). Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Kvalitet påvisning av bibliotek og cDNA størrelsesDistribusjon av Ins1-RFP+ celler av en parallell kapillært geleelektroforese instrument. (A) representant resultatet av vellykket pre forsterket cDNA. Normalt cDNA profilen skal være over 500 bp med en ~1.5–2 kb topp. (B) representant resultatet av pre forsterket cDNA med en primer dimer topp. Primer dimer toppen er ca 100 bp. (C) profilen til pre forsterket cDNA med fragmenter mellom 100 bp og 500 bp indikerer muligheten for cDNA fornedrelse. (D) størrelsesDistribusjon av cDNA bibliotek varierer mellom 250 bp og 450 bp etter rensing trinnene nevnt i denne protokollen. (E) uttrykket nivåer av Ins2 i cDNA bibliotek av qPCR (venstre) og relativ sekvensering data (høyre). X-axes representerer forskjellige 8 enkeltcelle prøver. Y-aksen (venstre) representerer normaliserte ΔCt i forhold til Gapdh (CtGapdh- CtIns2 + 6) og y-aksen (høyre) representerer normalisert uttrykk nivå av Ins2 i forhold til Gapdh (Logg2(TPM Ins2 / TPMGapdh)). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: bioinformatikk analyser av encellede transcriptome dataene. (A) rørledning bioinformatikk analyser. (B) sekvensering kvalitetspoeng over alle baser av lyder. (C) fordeling av tilordnede Les teller. (D) distribusjon av oppdaget genet teller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Komponent | Volum (µL) |
| Revers transkriptase (200 U/µL) | 0,5 |
| RNase hemmer | 0,25 |
| Første-strand buffer (5 x) | 2 |
| DTT (100 mM) | 0,5 |
| Betaine (5 M) | 2 |
| MgCl2 (1 M) | 0,06 |
| TSO (100 ΜM) | 0,1 |
| Nuclease-fritt vann | 0.29 |
| Totalt | 5.7 |
Tabell 1: RT reagens blande komponenter i en 5.7 µL reaksjon for hvert utvalg.
| Komponent | Volum (µL) |
| Første-strand reaksjon | 10 |
| DNA utvalg (2 x ReadyMix) | 12.5 |
| ER PCR primere (10 µM) | 0,25 |
| Nuclease-fritt vann | 2,25 |
| Totalt | 25 |
Tabell 2: PCR pre forsterkning reagens blande komponenter i en 25 µL reaksjon for hver prøve
| Komponent | Volum (µL) |
| SYBR grønn Master Mix | 5 |
| Primere (5 µM) | 0,5 |
| Nuclease-fritt vann | 2.5 |
| cDNA | 2 |
| Totalt | 10 |
Tabell 3: qPCR reagens blande komponenter i en 10 µL reaksjon ved hjelp av en standard 384-vel-plate.
| Komponent | Volum (µL) |
| 5 x TTBL | 1.6 |
| 2 ng cDNA | Variabel |
| ddH2O | Variabel |
| TTE blanding V5 | 2 |
| Totalt | 8 |
Tabell 4: Tagmentation reagens blande komponenter i en 8 µL reaksjon for hvert utvalg.
| Komponent | Volum (µL) |
| ddH2O | 1.6 |
| Produkt av forrige trinn | 10 |
| 5 x kategorien | 4 |
| N6XX | 2 |
| N8XX | 2 |
| TAE | 0,4 |
| Totalt | 20 |
Tabell 5: Berikelse PCR reagens blanding komponenter i en 20 µL reaksjon for hvert utvalg.
| Trinn | Problem | Muligheten | Løsning |
| 1.3.4 | Gli av klyper | Den ytre overflaten av tarmen er våt forårsaket av eksistensen av den lille mengden interstitiell væske og collegenase leakness | Forsiktig bytte tolvfingertarmen veggen og andre organ veggene i bukhulen med bomull vattpinner |
| 1.3.6 | Tarmen burst | Flytende trykket er for høy i tarmen | Senke hastigheten injeksjon |
| 2.6 | Holmer stikke til exocrine vev ved plukking holmer | Nok fordøyelse | Forlenge hele fordøyelsen og rister styrke |
| 5.3 | CDNA avkastningen er lav etter PCR forsterkning | Cellene er i dårlig forfatning | Holde celler frisk og i god stand |
| 5.4 eller 6.4 | Primer dimers kan sees | Overdreven primere | Rense cDNA en gang med DNA rensing perler (0.8:1 eller 1:1 ratio) |
| 5.4 | Dårligere cDNA etter PCR forsterkning | Dårlig kvalitet celleområde eller forurenset reagenser | Holde celler i god stand eller endre reagenser |
| 6.3 | Mengden av DNA er lav etter bibliotek | For få PCR sykluser eller kvaliteten på cDNA er ikke bra | Øke antall sykluser eller sikre cDNA kvalitet før biblioteket bygging |
Tabell 6: feilsøking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen viste vi en effektiv og lett-å-bruke metode for å studere encellede uttrykket profiler av bukspyttkjertelen β celler. Denne metoden kan brukes til å isolere endokrine celler fra embryonale, neonatal og postnatal pancreases og utføre encellede transcriptomic analyser.
Det viktigste trinnet er isolering av enkelt β celler i god stand. Fullt parfyme pancreases svare bedre senere fordøyelsen. Utilstrekkelig perfusjon, som vanligvis oppstår i dorsal bukspyttkjertelen, vil resultere i en lav Holme avkastning. Etter perfusjon krever tiden fordøyelsen og risting intensitet spesiell oppmerksomhet. Over fordøyelsen, som følge av lang incubation ganger og energisk kan risting, bryte øyene i biter. Utilstrekkelig fordøyelsen vil ikke helt skille øyene fra tilstøtende vev. Etter fordøyelsen av bukspyttkjertelen, ble øyene renset ved hånden plukke i stedet for tetthet gradert sentrifugering. Selv om tetthet gradert sentrifugering kan berike holmer, forkastes feilaktig mange små holmer eller holmer med acinar vev. Prøv å unngå å plukke acinar vev, som kan forårsake ineffektive trypsin fordøyelsen og redusere renheten av β cellene.
Uavhengige biologiske gjentak er nødvendig for skille biologisk variasjon og satsvis effekter. Hvis to biologiske replikerer har et lignende mønster i PCA og inkluderer lignende sub grupper i klynger resultater, disse prøvene kan avsløre pålitelig biologisk variasjon. Ellers må ekstra biologiske gjentak bekrefte resultatene. For en metabolsk organ som bukspyttkjertelen, kan celle staten tilknyttet circadian klokken24 konto for satsvis forskjeller. For å løse dette problemet, anbefales det å samle alle prøver på samme tid på dagen.
Begrensning av denne tilnærmingen er lav overføringshastighet fordi vi har å konstruere et bibliotek for hver celle. På grunn av overdreven primerne i reaksjonen, cDNA før og etter biblioteket generelt bør være renset for å fjerne primer dimers. Disse prosessene er tidkrevende. Nylig ble en endret protokoll25 rapportert som kan løse dette problemet i noen grad. I denne protokollen merker cellen-spesifikke strekkoden cDNA fragmenter under det omvendte transkripsjon steget. Derfor cDNA i hver celle kan samordnes sammen og så bli renset, etterfulgt av biblioteket konstruksjon. Denne endringen øker gjennomstrømningen av biblioteket. Men dette endret metoden er mindre sensitiv og oppdager færre gener per celle. Dessuten, er denne metoden en 3' telling metoden med redusert Les dekning. Smart-seq2 er derfor fortsatt den mest hensiktsmessige metoden for bukspyttkjertelen utvikling.
Bukspyttkjertelen utarbeidelse fra andre arter kan være forskjellig. For menneskelige bukspyttkjertelen, kan øyene være isolert etter tidligere protokoller26,27. Deretter de isolerte småøyer enzymene i enkeltceller28 og utføre encellede analyser ved hjelp av denne metoden. Denne metoden kan bli mye brukt til forskning av pattedyr bukspyttkjertelen utvikling, sykdommer og gjenfødelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker National Center for Protein Sciences, Beijing (Peking University) og Peking-Tsinghua Center for Life Science Computing plattform. Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi i Kina (2015CB942800), National Natural Science Foundation av Kina (31521004, 31471358 og 31522036) og støtte fra Peking-Tsinghua Center for biovitenskap til C.-R.X.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30VN-3' |
||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3' |
||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3' |
||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3' |
||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3' |
||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3' |
||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3' |
References
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A.
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).
- Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
- Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).
- Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
- Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).
- Hadley, W. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Springer Science & Business Media. (2009).
- Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. , Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. , (2017).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).
