Analyse transcriptomique unicellulaire de cellules endocrines pancréatiques de souris

Résumé

Nous décrivons une méthode pour isoler des cellules endocrines du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals suivies par séquençage de RNA unicellulaires. Cette méthode permet des analyses du développement de la lignée endocrine du pancréas, de la cellule hétérogénéité et transcriptomique dynamique.

Résumé

Les cellules endocrines du pancréas, qui sont regroupées en îlots, réglementent la stabilité de glucose de sang et le métabolisme énergétique. Les types cellulaires distincts dans les îlots, y compris les cellules sécrétrices d’insuline β, sont distinguent des progéniteurs endocriniens communes durant le stade embryonnaire. Cellules endocrines immatures étendre via la prolifération cellulaire et mûrissent durant une période de développement longtemps après la naissance. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces processus ne sont pas clairement définis. Unicellulaire RNA-sequencing est une approche prometteuse pour la caractérisation de populations cellulaires distincts et voies de différenciation lignée suivi cellulaire. Nous décrivons ici une méthode pour la cellule unique RNA-séquençage des cellules β du pancréas isolé du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals.

Introduction

Le pancréas est un organe vital métabolique chez les mammifères. Le pancréas est composé de compartiments endocrines et exocrines. Les cellules endocrines du pancréas, y compris les cellules productrices d’insuline β et cellules productrices de glucagon α, cluster ensemble dans les îlots de Langerhans et coordonnée de réguler l’homéostasie du glucose systémique. La dysfonction des cellules endocrines entraîne dans mellitus de diabète, qui est devenue un enjeu majeur de santé publique dans le monde entier.

Les cellules endocrines du pancréas sont dérivés de Ngn3⁺ progéniteurs au cours de l’embryogenèse¹. Pl....

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Pékin.

1. pancréas isolement

1. Pour les embryons E17.5 (embryonnaire jour 17,5) :
   1. Estimer embryonnaire jour 0,5 d’après le point dans le temps lorsque la fiche vaginale apparaît.
   2. Sacrifier les souris enceintes en CO₂ administration. Vaporiser la fourrure abdominale avec 70 % d’alcool.
   3. Faire une incision en forme de V avec des ciseaux de la région génitale, s’étendant aux côtes. Ce processus s’ouvre complètement la cavité abdominale.
   4. ....

Résultats

Pancréas ont été disséqués souris embryonnaires, néonatals et postnatals (Figure 2 a et 2 b). Pour plus de jours après la naissance 18 souris, l’effet digestif dépend du degré de perfusion ; par conséquent, l’injection est l’étape la plus importante pour l’isolement des îlots pancréatiques (Figure 2-2E et le tableau 6). Autant collagénase a été injectée comme c’.......

Discussion

Dans ce protocole, nous avons démontré une méthode efficace et facile à utiliser pour étudier les profils d’expression unicellulaire des cellules β pancréatiques. Cette méthode pourrait être utilisée pour isoler les cellules endocrines du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals et d’effectuer des analyses transcriptomiques unicellulaires.

L’étape la plus critique est l’isolement des cellules β unique en bon état. Pancréas complètement perfusés répondent mieux à la digestion ultérieure........

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Collagénase P	Roche	11213873001
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol	Thermo Fisher Scientific	25200114
Sérum fœtal bovin (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Dumont #4 Forceps	Roboz	RS-4904
Dumont #5 Forceps	Roboz	RS-5058
30 G BD Needle 1/2" Longueur	Microscope stéréo BD	305106
	Zeiss	Stemi DV4
	Zeiss	Stereo Lumar V12
	Centrifugeuse Eppendorf	5810R
Eppendorf	5424R
Tube à fond rond en polystyrène avec capuchon de crépine	BD-Falcon	352235
Microplaque PCR 96 puits	Axygen	PCR-96-C
Tapis d’étanchéité en silicone	Axygen	AM-96-PCR-RD
Tube PCR à puits mince	Extragène	P-02X8-CF
Trieur de cellules	BD Biosciences	BD FACSAria
Pipette capillaire	Sutter	B100-58-10
RNaseZap	Ambion	AM9780
ERCC RNA Spike-In Mix	Life Technologies	4456740
Eau distillée	Gibco	10977
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
dNTP mix	New England Biolabs	N0447
Inhibiteur de la RNase recombinante	Takara	2313
Superscript II transcriptase inverse	Invitrogen	18064-014
Tampon premier brin (5x)	Invitrogen	18064-014
DTT	Invitrogen	18064-014
Bétaïne	Sigma-Aldrich	107-43-7
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Eau sans nucléase	Invitrogen	AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)	KAPA Biosystems	KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP billes	Vazyme	N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix	Vazyme	Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Prep Kit de préparation V2 pour Illumina	Vazyme	TD502	Comprend 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 pour Illumina	Vazyme	TD203	Comprend 16 N6XX et 24 N8XX
Kit d’analyse de fragments NGS haute sensibilité	Advanced Analytical Technologies Advanced Analytical Technologies	DNF-474
1x HBSS sans Ca2+ et Mg2+			138 mM NaCl ; 5,34 mM KCl 4,17 mM NaHCO3 ; 0,34 mM Na2HPO4 0,44 mM KH2PO4
		d’isolement	1 × ; HBSS contenant 10 mM d’HEPES, 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucose, pH 7,4
tampon			1 & times ; HBSS contenant 15 mM HEPES, 5,6 mM de glucose, 1 % FBS, pH 7,4
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2393
Oligo-dT30VN amorce			5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30 VN-3'TSO
			5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR
amorces			5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Amorce			5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'
Gapdh Amorce			5'- GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Amorce			avant 5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'
Ins2 Amorce			inversée 5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'

Microscope à fluorescence stéréo Centrifugeuse Tampon FACS avant inverse