Summary
単一細胞 RNA シーケンス続いて胎生期、新生児および生後の膵臓内分泌細胞の単離方法について述べる。この方法により、分析、膵内分泌系統の開発の細胞の不均一性とトランスクリプトームのダイナミクス。
Abstract
ランゲルハンス島におけるクラスター化されて、膵臓の内分泌細胞は、血液グルコースの安定性とエネルギー代謝を調節します。Β 細胞のインスリン分泌を含む島の明瞭な細胞の種類は萌芽期の段階の間に一般的な内分泌前駆細胞と区別されます。未熟な内分泌細胞は細胞増殖を介して展開し、長い生後発達期間中に成熟します。しかし、これらのプロセスの基になるメカニズムは明確には定義されていません。単一細胞の RNA シーケンスは、異なる細胞集団およびトレース細胞系統分化経路の評価の有望なアプローチです。ここでは、胎生期、新生児および生後の膵臓から分離膵 β 細胞の単一細胞の RNA シーケンスの手法について述べる。
Introduction
膵臓は、哺乳類の重要な新陳代謝器官です。膵臓は、内分泌と外分泌のコンパートメントで構成されます。インスリン産生 β 細胞と α 細胞のグルカゴン産生などを含む膵の内分泌細胞はランゲルハンス島で一緒にクラスターし、協調全身グルコース恒常性を調節します。内分泌細胞の機能不全は、世界中の主要な公衆衛生問題となっている糖尿病の結果します。
膵内分泌細胞由来 Ngn3+前駆細胞胚1中。その後、周産期、内分泌細胞はフォーム未熟な小島に増殖します。これらの未熟な細胞は、開発し、大人2血液グルコースの恒常性を調節する血管になる豊かな成熟した小島を徐々 にしていきます。
Β 細胞の分化を制御する転写因子群が確認されていますが、β 細胞の成熟の正確な経路はまだはっきりしません。また、β 細胞の成熟過程にはセル数拡張3,4の規制と細胞異質性5,6世代も行われます。しかし、これらのプロセスの制御機構がよく研究されていません。
単一細胞の RNA シーケンスは、細胞の亜集団をプロファイルおよびセル血統発達経路7をトレースできるようにする強力なアプローチです。この技術では、単一セルのレベル8で膵島の開発中に発生するイベントを解読するキーを利用してください。単一細胞の RNA シーケンス プロトコルの中では、スマート seq2 は、感度の向上と精度、低コスト9時標準試薬の使用と完全長 cDNA の生成を可能です。スマート seq2 はシーケンス10の cDNA ライブラリを組み立てるに約 2 日かかります。
ここでは、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを使用してアダルト Ins1 RFP トランスジェニック マウス11、胎児の膵臓からの蛍光標識 β 細胞の分離法を提案し、トランスクリプトームのパフォーマンス解析で、スマート seq2 技術 (図 1) を使用して単一細胞レベル。このプロトコルは、通常、病理学的およびエージングの状態であらゆる膵内分泌細胞のトランスクリプトームを解析する拡張できます。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の北京大学によって承認されています。
1. 膵臓分離
-
E17.5 (萌芽期日 17.5) 胚。
- 日 0.5 膣のプラグが表示されたら時間点に基づく推定します。
- CO2管理によって妊娠マウスを犠牲に。70% アルコールで腹部の毛皮をスプレーします。
- 肋骨に性器拡張からハサミで V 字切開を確認します。このプロセスは完全に腹腔内にオープンします。
- 腹腔内から子宮の解剖し、冷 PBS を含む 10 cm 皿に置きます。
- 胎盤や臍帯などの他の組織を削除する、顕微鏡下で細い先端の鉗子で子宮から胎児を解剖します。冷 PBS を含む 10 cm 皿にすべての胚を置きます。
- 胚の腹部キャビティを開いて涙し、ロング ピンセットで内臓組織を掘る。冷 PBS を含む 6 cm 黒底皿に内臓組織を転送します。
- 膵臓は、腹部の左上にあるし、12胃、脾臓、十二指腸 (図 2 aで黄色の点線) にアタッチします。鉗子による内臓の組織から膵臓をデタッチし、0.5 mg/mL 冷たいコラゲナーゼ溶液 5 mL を 20 mL のバイアルに膵組織を一緒に分かち合う: 分離バッファー (10 mM HEPES、1 mM MgCl2を含む HBSS で 0.5 mg/mL コラゲナーゼ P、5 mM グルコース、pH 7.4)。
-
マウスの P0 P15 (生後 0-15)。
- 犠牲にしテープでベンチトップ プロテクターの部分に手足を遵守することにより、マウスを修正します。70% アルコールで腹部の毛皮をスプレーします。
- 1.1.3 の手順で説明するよう完全に腹腔内を開きます。マウスの左側には、腸を引き出します。この手順は、膵臓、胃、十二指腸および脾臓の葉を公開します。慎重に膵臓 (図 2 b)12のすべての葉を解剖し、0.5 mg/mL 冷たいコラゲナーゼ溶液 5 mL を 20 mL のバイアルに膵組織を一緒にプールします。
-
P18 P60 (生後 18-60) マウス。
- コラゲナーゼ溶液を調製します。氷の上の使用のための準備ができるまで維持します。
- マウスを犠牲にし (ステップ 1.1.2 および 1.1.3) 上記のように腹腔内を開きます。
注: は、肝臓を傷つけることはありません、肝臓への傷が胆管に流れの圧力を減らすし、次のステップの灌流効率が低下します。 - 剣を削除します。マウスの右側に腸を引き、(図 2の白矢印) 胆嚢と総胆管を公開する両側に肝臓の左、内側右葉をプッシュします。
- 胆管が十二指腸 (図 2 D) を入力する場所のサイトの側面上部と下部の位置に小型船舶用クランプのペアで十二指腸をクランプします。
注: は、膵臓の胃や脾葉を固定しないで。コラゲナーゼの解決はクランプされる場合次の手順で膵臓胃・脾葉に流入されません。 - 0.5 mg/mL 冷たいコラゲナーゼ溶液の 5 ml 注射器を入力し、胆嚢に 30 G の針を挿入します。慎重にかつスムーズに、胆管に針を刺してを操作します。
- 0.5 mg/mL の冷たいコラゲナーゼ溶液、マウスの大きさに応じて 1-5 mL を注入することにより膵臓を灌流します。注射は、ゆっくりと針の管の滑りを防ぐために、腸が高い液体の圧力の下で破裂するを防ぐために一定にする必要があります。注射は、膵臓が完全に展開したら完了です。
- 灌流後すぐに鉗子を用いた腹腔内から膵臓 (図 2 Dの黄色点線線) を解剖します。20 mL バイアル 0.5 mg/mL 冷たいコラゲナーゼ溶液 5 mL にティッシュを置きます。一度に 1 つ以上のマウスの操作、マウス 1 つずつを灌流し、20 mL バイアルに冷たいコラゲナーゼの解決すべてのマウスを解剖まで組織にプールします。
2. コラゲナーゼの消化力および膵島分離
- 37 ° C の水浴に膵組織を含む 20 mL バイアルを置き、温度を平衡に 3 分間インキュベートします。
- 別の 3 〜 5 分の管を軽く振る。膵組織は完全に膨張された場合、まで均一に存在して最終的には、小さい組織の部分に切り離す徐々 に。消化時間膵臓サイズと灌流効率によって異なります。
- 新しい 50 mL の遠心管に 0.25 mm ナイロンこし器を通って消化の製品をフィルター処理します。氷冷 PBS の入った 20 mL 注射を使用してストレーナーを洗う徹底的。
- E17.5 P15 膵臓、3.1 の手順に進みます。
- P18 P60 膵臓 1 分 200 × gで遠心分離し、上澄みを廃棄します。再冷 PBS で組織を中断します。
- 組織懸濁液 5 mL を 6 cm 黒底皿に注ぐ。膵島は、小型でコンパクト、乳白色白い構造であり、腺房組織が緩いと半透明の白。200 μ L ピペットの島をピックアップし、冷 PBS の少量を含む 1.5 mL チューブにそれらを転送します。
3. 膵組織の島トリプシンの消化力
- 膵組織または 200 x g 4 ° C で 1 分で小島を含むチューブを遠心し、ペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。
- 0.25% トリプシン-EDTA の餌を再停止し、37 ° C の水浴で孵化させなさい。インキュベーションの 4 分後ゆっくりと時折 200 μ L のヒントを使用して 1 分 (ピペット) を吸引します。
注: E17.5 P3 膵臓 1 mL のトリプシン-EDTA を追加します。P4 P15 膵臓 3 mL のトリプシン-EDTA を追加します。100-300 の島々 に 1 mL のトリプシン-EDTA を追加します。組織の量によるとトリプシン-EDTA の量を調整します。 - 冷たい牛胎児血清 (FBS) 0.4 x ボリュームを追加することによって、消化を停止し、穏やかな渦によるミックスします。
- 250 x gで 4 ° C で 3 分間遠心ペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。
- 200 μ L 冷たい FACS バッファーを持つセルを再停止 (HBSS 含有 1 %fbs、pH 7.4)。5 mL FACS チューブに細胞を転送します。
- 未消化の大きな組織破片を除去するフィルターを通過する細胞懸濁液を許可する FACS チューブをすぐにスピンします。管内単一細胞懸濁液は、FACS の並べ替えに準備が整いました。
4. 単一セル換散
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セル換散バッファーを準備します。
注: は、層流と紫外線殺菌のフードの下ですべての実験を実行します。すべてのチューブ、プレート、ピペット チップがある RNase-/DNase 無料します。フードと RNase 距離を使用する前に、ソリューションとピペットを消毒します。- 氷の上の試薬を解凍: dNTP (10 mM)、oligo dT プライマー (10 μ M)、および ERCC の貯蔵液 (1:20)。
- 希釈 1:5 x 10 ERCC5ヌクレアーゼ フリー水。
- 必要なセル換散バッファーのボリュームを計算します。RNase 阻害剤 (40 U/μ L)、0.2% (巻/巻) トリトン X-100、dNTP、oligo dT プライマーの 1 μ L、4.05 μ L 各セルのための最終的なボリュームに希釈 ERCC 0.05 μ の 1 μ L の 1.9 μ L の 0.1 μ L を追加します。
- 0.2 mL 薄肉 8 ストライプ PCR チューブや 96 ウェルのプレートにセル換散バッファーの約数。遠心分離機管または 30 用プレート 4 ° C で s
注: 7500 g と次の手順で 800 x g で 96 ウェルプレート x 0.2 mL 薄肉 8 ストライプ PCR チューブ遠心分離機します。
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単一セルのピッキングおよび換散。
- 手動でピックアップ FACS は 30-40 μ m キャピラリー ピペットを使用して 8 ストリップ PCR チューブに Ins1 RFP+ FACS バッファー内の単一のセルを並べ替えまたは 96 ウェルのプレートに直接 Ins1 RFP+単一セルを並べ替えます。単一のセルを含むボリュームは、未満 0.3 μ L と見なされます。
注: 使用前方散乱高さ (FSC H) vs 転送の散布面積ダブレット差別 (FSC A) ゲート戦略、FSC H の対側の散布面積破片および蛍光 Ins1 RFP+細胞 (図 3 a-3) 選別のゲート (SSC A)。ピッキング法 300 μ L FACS バッファーを含む 1.5 mL チューブに標的細胞を並べ替えます。適切な最終濃度は 5-10 細胞/μ L です。バッファーのボリュームを調整します。プレート コレクション メソッドの計測器のマニュアルに従い 96 ウェル プレートの各ウェルに単一セルの並べ替え。7,13 - 渦管や細胞を溶解し、RNA をリリース プレート。遠心分離機管または 30 のプレート s 4 ° C で、すぐに氷の上に置いて。
注: セルは-80 ° C で 1 週間保存できます。
- 手動でピックアップ FACS は 30-40 μ m キャピラリー ピペットを使用して 8 ストリップ PCR チューブに Ins1 RFP+ FACS バッファー内の単一のセルを並べ替えまたは 96 ウェルのプレートに直接 Ins1 RFP+単一セルを並べ替えます。単一のセルを含むボリュームは、未満 0.3 μ L と見なされます。
5. 単一細胞 cDNA 増幅
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逆のトランスクリプション (RT)。
- 氷の上の RT 試薬 (表 1) を解凍します。
- 72 ° C、3 分でサンプルをインキュベートし、ただちにチューブやプレートで少なくとも 1 分間氷の上簡潔に遠心分離機管または 30 のプレート 4 ° C で s
注: すべての孵化に 105 ° C 加熱蓋付きサーマルサイクラーを使用します。 - 表 1に記載されてすべての反応の RT ミックスを準備します。
- 5.7 μ 10 μ L のボリュームを表示するには、各サンプルに RT ミックスを調剤します。優しく渦ミックスと 30 の遠心 4 ° C で s
- サーマルサイクラーにサンプルを置き、RT プログラムを次のように開始: 42 ° C、90 分、10 サイクル (50 ° C を 2 分、2 分の 42 ° C)、70 ° C、4 ° C で 15 分押し
-
Pcr 前。
- 雪解けの氷の上の PCR 試薬 (表 2)。
- 表 2に説明されているように反応、PCR ミックスを準備します。
- 最初繊維の反応が含まれている各サンプルに PCR ミックスの 15 μ L を分注します。優しく渦ミックスと 30 の遠心 4 ° C で s
- サーマルサイクラーにサンプルを置き、次の PCR プログラムを開始: 18 サイクル 3 分の 98 ° C (98 ° C、20 s、67 ° C、15 秒、6 分の 72 ° C)、4 ° C で 5 分押しのための 72 ° C
注: 1 週間未満の 4 ° c またはに-20 ° C/-80 ° C まで 6 ヶ月間は、PCR の製品を格納できます。
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PCR の浄化。
- 渦で混ぜる前の手順から再度中断された DNA 精製ビーズ (1 x) の 25 μ L を各サンプルに追加します。その後、すぐにスピン チューブや液体を収集するビーズの決済を避けるため室温でプレートも。
注: 平衡室温 15 分、徹底的に使用する前に渦に DNA 精製ビーズです。 - 室温で 5 分間インキュベートします。
- 場所チューブまたは適切な磁気プレート ソリューションが明確になるまで我慢し、慎重に削除、上澄みを廃棄します。
- マグネット スタンド、ビーズを洗浄する作りたての 80% エタノール 200 μ L を追加し、インキュベートする 30 秒、慎重に削除、エタノール溶液を廃棄します。
注: 80% (巻/巻) エタノール溶液準備されるべき新鮮なたびに。 - 2 洗浄の合計は 5.3.4 のステップを繰り返します。
- 慎重に削除し、残りを破棄エタノール溶液と空気乾燥管しながらビーズやプレート、マグネット スタンドに。
注: は、最大溶出効率性を確保するためにビーズを過乾燥を避けてください。 - ヌクレアーゼ フリー水ビーズから DNA ターゲットを溶出し、ボルテックスでよく混ぜるの 11 μ L を追加します。すぐにチューブまたはプレートをスピンし、ソリューションがクリアされるまで、マグネット スタンドに配置。サンプルの 10 μ L を新しい PCR チューブに転送します。
注: は cDNA のサイズ分布検出に基づく浄化の単一のラウンド後二量体が存在する場合、ダイマーを完全に削除するに再びに浄化します。サンプルのままに許可されている場合、ダイマーは cDNA 収量計算に影響します。
- 渦で混ぜる前の手順から再度中断された DNA 精製ビーズ (1 x) の 25 μ L を各サンプルに追加します。その後、すぐにスピン チューブや液体を収集するビーズの決済を避けるため室温でプレートも。
-
CDNA の品質チェック。
- 蛍光光度計を用いた cDNA 収量を検出するサンプルをランダムに選択します。
- リアルタイム PCR (qPCR) (図 4E) によるマーカー遺伝子の発現レベルを評価します。40 倍に希釈を qPCR 384 ウェル プレートを使用してを実行するサンプルの 1 μ L を削除します。表 3で説明するように、qPCR ミックスを準備します。サイクリング条件: 10 分、45 サイクル 95 ° C (95 ° C、10 s、60 ° C、15 s、15 のための 72 ° C s)。
- 並列キャピラリー電気泳動装置を用いてサイズ分布を検出するサンプルをランダムに選択します。
6. cDNA ライブラリーの構築
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Tn5 トランスポサーゼによる Tagmentation 反応。
- 5.4.2、蛍光光度計を使用しての手順から qPCR 選択細胞の cDNA 収量を検出します。出発原料として cDNA の使用 2 ng。
- 雪解けの氷の上の tagmentation 反応試薬 (表 4)。
- 0.2 mL 薄肉 8 ストライプ PCR チューブ、表 4で説明したように tagmentation 反応を準備し、渦によって慎重にミックスします。その後、すぐに室温でソリューションをスピンダウンします。
- 4 ° C で 10 分の 55 ° C にサンプルをインキュベートを押し
- すぐに tagmented の反作用を停止する DNA を含む各サンプルに 5 x TS の 2 μ L を追加します。渦によって慎重に混合し、後、すぐに室温でソリューションをスピンダウンします。
- 室温で 5 分間混合物を孵化させなさい。DNA はすぐに最終的な濃縮 PCR 処理する必要があります。
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アダプター結紮断片の増幅。
- 雪解けの氷の上の PCR 試薬 (表 5)。
- 表 5に記載されている、濃縮 PCR ミックスを準備し、渦による慎重にミックスします。その後、すぐに室温でソリューションをスピンダウンします。
- 次のプログラムを使用して PCR を実行: 30 98 ° C, 10 分間の 72 ° C s、8 サイクル (98 ° C、15 s、60 ° C、30 s、72 ° C、3 分)、4 ° C で 5 分押しのための 72 ° C
注: サイクル数は、予想されるライブラリ DNA 量に依存します。
-
サイズ選択と PCR の浄化。
- 渦で混ぜる前の手順から再度中断された DNA 精製ビーズ (0.7 倍) の 14 μ L を各サンプルに追加します。その後、すぐにスピン液体を収集するビーズの決済を避けるため室温でチューブ。
注: 平衡室温 15 分、徹底的に使用する前に渦に DNA 精製ビーズです。 - 室温で 5 分間インキュベートします。
- ソリューションが明確になるまで、適切なマグネット スタンドにチューブを配置、慎重に上清を新しいチューブ ストリップに転送、破棄前のチューブ ストライプ。
- 再浮遊 DNA 精製ビーズの 3 μ L を追加 (0.15 x) 各サンプル チューブ ストライプと渦で混ぜるに。その後、すぐに室温でチューブをスピンします。
- 室温で 5 分間インキュベートします。
- 場所チューブまたは適切な磁気プレート ソリューションが明確になるまで我慢し、慎重に削除、上澄みを廃棄します。
- マグネット スタンド、ビーズを洗浄する作りたての 80% エタノール 200 μ L を追加し、インキュベートする 30 秒、慎重に削除、エタノール溶液を廃棄します。
注: 80% (巻/巻) エタノール溶液準備されるべき新鮮なたびに。 - 2 洗浄の合計 6.3.7 のステップを繰り返します。
- 慎重に削除し、残りを破棄エタノール溶液と空気乾燥管しながらビーズやプレート、マグネット スタンドに。
注: は、最大溶出効率性を確保するためにビーズを過乾燥を避けてください。 - ヌクレアーゼ フリー水ビーズから DNA ターゲットを溶出し、ボルテックスでよく混ぜるの 11 μ L を追加します。すぐにチューブまたはプレートをスピンし、ソリューションがクリアされるまで、マグネット スタンドに配置。サンプルの 10 μ L を新しいチューブ ストライプに転送します。
- 渦で混ぜる前の手順から再度中断された DNA 精製ビーズ (0.7 倍) の 14 μ L を各サンプルに追加します。その後、すぐにスピン液体を収集するビーズの決済を避けるため室温でチューブ。
-
最終的な cDNA ライブラリの品質チェック。
- 蛍光光度計を使用して各ライブラリの濃度を測定し、並列キャピラリー電気泳動装置を用いてサイズ分布を確認します。
注: DNA の収穫は通常、ライブラリごとに 15-25 ng の間に。250 から及ぶ断片 450 に bp bp を観察します。サイズ分布チェックによって確認されるように、浄化後二量体が残っている場合は、1 つより多くの時間 DNA 精製ビーズ × 1 と浄化します。
- 蛍光光度計を使用して各ライブラリの濃度を測定し、並列キャピラリー電気泳動装置を用いてサイズ分布を確認します。
-
ライブラリのプーリング
- おおよそフラグメントのサイズ、N6XX と N8XX のアダプターの同じ組み合わせを含むそれらのどれもを確保、各サンプルから DNA のプール等しい量に基づいています。
7. DNA の配列
- 高スループット シーケンスを用いた 51 bp シングル エンド配列のバーコード ライブラリを対象します。次の製造元のプロトコル シーケンスを実行します。各セルの配列の深さは、約 100 万を読み取り平均8、少なくとも 50 万セル14あたりの読み取り数です。
8. バイオインフォマティクス解析
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品質評価と配置をシーケンスします。
- 次のパラメーターで FastQC (v0.11.3)15を使用してシーケンスされた読み取りの評価:"fastqc - 抽出 -o しかし input_fastq"。
- コマンドを使用して ERCC シーケンスをマウスのゲノムをマージ"猫の mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa」。
- Bowtie2 をビルド (v2.2.5)16インデックス次のパラメーターで:「bowtie2 ビルド mm10_ERCC.fa mm10_ERCC」。
- Tophat2 を使用して読み取りを配置 (バージョン 2.1.0)17次のパラメーターで:「tophat2 -o しかし G gene.gtf - トランスクリプトーム インデックス trans_index mm10_ERCC input_fastq」。
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遺伝子発現のレベルを定量化します。
- HTSeq (v 0.6.0)18を使用して、次のパラメーターで各遺伝子の読み取り数マップ: ' htseq カウント-f bam-r pos s ない-、30 の accepted_hits.bam gene.gtf > read_count.txt」。
- 百万 (TPM)19あたりの成績証明書に遺伝子発現レベルを正規化します。
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細胞の品質管理。
- 未満 50 万マップリードまたは 4,000 未満の遺伝子細胞を除外する (TPM > 1)。
注: 除外の条件は、セル型のシーケンスの深さに依存します。 - 内分泌マーカー ( Gcg α 細胞の β 細胞のIns1 など) を発現する細胞を保持し、非内分泌マーカー (白血球のSpi1 など) を表現するセルを除外します。
- 未満 50 万マップリードまたは 4,000 未満の遺伝子細胞を除外する (TPM > 1)。
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主成分分析 (PCA)
- 前述の20としてスパイク アドイン ERCC に従って非常に可変の遺伝子を識別します。
- PCA r「PCA」パッケージ FactoMineR (v1.31.4)21、関数を使用してを実行 log2(TPM + 0.1) の高い変数遺伝子。
- Ggplot2 で主成分分析結果を可視化する (v2.0.0)22。
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階層的クラスタ リングします。
- FactoMineR (v1.31.4)21"dimdesc"関数を使用して最高の主成分 (PC) 荷重の遺伝子を識別します。
- Log2 の R パッケージ gplots (v3.0.1)23"heatmap.2"関数を使用して階層的なクラスタ リングを行う (TPM + 1) 遺伝子を読み込んで高 PC の相対値。
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Representative Results
胎生期、新生児および生後のマウスから切除した膵臓 (図 2 a と2 b)。生後 18 日目より古いマウス消化効果は異なります; 灌流の程度したがって、注射は膵島の分離のための最も重要なステップ (図 2-2Eと表 6)。できるだけコラゲナーゼは、このステップの間に膵臓を埋めることができるほどに注入しました。完全に膨張した膵臓が図 2 Dで表示されます。灌流が成功した (図 2 e) ではないが貴重なサンプル、膵臓が十分な消化後の小さな断片に破れたことができます。
灌流後、膵組織は小さな断片 (図 2 f) の島を解放するために消化されました。FACS の並べ替え時間の短縮、小島を事前に選ぶことによって内分泌細胞を濃縮しました。小島のサイズは、マウスの年齢と消化の強さに応じて異なる場合があります。時折、島は円形ではありません。小島は、色とコンパクトな状態 (図 2および表 6) に従って選択必要があります。トランスジェニック マウスの緊張は GFP など内分泌の細胞のための RFP のレポーターの遺伝子を持っている場合に小島は、蛍光顕微鏡下で選ぶことができます。
Ins1 RFP+細胞 (図 3 a-3 C) を並べ替え、FACS により精製され、単一のセルは、キャピラリー ピペットを用いた単一細胞 RNA シーケンス (図 3 D) 選ばれました。500 を超える完全な長さを持つ必要があります正常に増幅 cDNA bp 2 kb 1.5 kb から豊かにすることとします。また、通常インスリン転写産物 (図 4 a) を表すことがあります Ins1 RFP+細胞 cDNA の 500-600 bp 濃縮があります。ただし、いくつか異常事態観測10 (表 6) されています。たとえば、cDNA 断片付近の 100 bp、プライマー二量体 (図 4 b)、通常 DNA 精製の手順を繰り返して、削除する必要があります余分なプライマーによって引き起こされます。プライマー二量体の存在は次のライブラリの構築に使用される合計 cDNA 収量の計算に影響を与えます。100 間の cDNA 断片 bp と 500 bp 通常表す劣化 cDNA (図 4)、RNase の混入など、悪い細胞の状態や試薬の問題によって引き起こされる。この条件の下で私たちは DNA 劣化の原因を特定し、障害を除外します。例えば、良いセルの状態をように組織を消化する必要があります迅速かつ優しく、セルを並べ替える必要がありますと操作は、あらゆる種類の汚染物質を避けるために慎重に実行する必要があります。
シーケンスの cDNA ライブラリの精製、DNA 精製ビーズの異なる比率をサンプルに追加するための手順で異なるサイズの cDNA 断片を取得しました。たとえば、我々 は 250 に至る cDNA を取得できます 450 追加 0.7 x と最初に DNA 精製ビーズ x 0.15 で bp と 2 番目に bp の浄化、それぞれラウンド (図 4)。このステップは、高い成功率を持っています。しかし、約 100 の断片がある場合 bp、ダイマー (表 6) を削除する DNA 精製ビーズ × 1 で再び図書館を浄化することを推奨します。外し DNA の定量化をスキューおよび各サンプルから凹凸データの獲得につながる結果をプーリング サンプルに影響を与えます。
バイオインフォマティクスのアプローチ (図 5 a) とシーケンス データ解析を行った。シーケンスの品質スコアは、品質評価 (図 5 b) をシーケンス処理中に 30 を超える必要があります。後、読み取りの 80-90% は参照ゲノムにマッピングされると予想されます。下流解析のための高品質の細胞を得るためには、我々 はより少ない 50 万マップリード セルを除外または 4,000 未満検出遺伝子 (図 5および5 D)。PCA と階層的クラスタ リングの後我々 の細胞の異なったグループを特徴し、された異なるグループ8に異質に表現される遺伝子を同定しました。
図 1: マウス膵内分泌細胞の単一細胞 RNA シーケンスの図式的な概観します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 膵臓郭清、灌流、膵島ピッキングします。(A) E17.5 胚 (上) (下) 萌芽期の膵組織の郭清。黄色の点線は、膵臓の組織を設定します。スケール バー = 1,000 μ m。 (B) P10 マウス (左) から (右) 産後の膵組織の郭清。スケール バー = 1,000 μ m. (C D) (C) の前に P60 マウスの膵組織および (D) 灌流後。黄色の点線は、膵臓の組織を設定します。白い矢印は、胆嚢を示します。(E) P60 マウスの部分的に灌流膵組織。赤い矢印は、膵の灌流も領域を示します。青色の矢印は、膵の灌流不良領域を示します。(上側) の前に (F) 膵組織と (下) のコラゲナーゼ消化後。(G) の矢印は、コラゲナーゼ消化膵臓組織から解放された島をポイントします。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 顕微鏡の下で 30-40 μ m 毛細管ピペットで細胞を手動で選択します。(A ~ C)折れ曲がり FACS ゲート Ins1 RFP+セルを並べ替え。(D) 明るい円を示す細胞、チューブ、キャピラリー ピペット。良い形態 (矢印) と、セルを選択し、セル (矢印) をクラスター化を無視します。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 並列キャピラリー電気泳動装置による Ins1 RFP+細胞の cDNA とライブラリのサイズ分布の品質検出します。正常にあらかじめ増幅 cDNA の代表者 (A) の結果です。通常、cDNA のプロファイルは、500 を超えるする必要があります ~1.5–2 kb ピーク時の bp。(B) プライマー二量体ピークを持つ中古増幅 cDNA の代表的な結果。プライマー二量体のピークが約 100 跪く (C) あらかじめ増幅 cDNA 断片でのプロファイル 100 bp と 500 bp cDNA の劣化の可能性があります。250 の間で及ぶ (D) cDNA のサイズ分布ライブラリ bp と 450 bp 次精製ステップがこのプロトコルに記載されています。式 (E) レベルIns2 qPCR (左) と相対して cDNA ライブラリ内のシーケンス データ (右)。横軸は、異なる 8 単一細胞サンプルを表します。Gapdh (CtGapdh- CtIns2 + 6) に対する正規化された ΔCt を表し、y 軸 (右) Ins2 Gapdh (ログ2(TPM基準の正規化された発現レベルを表します y 軸 (左)Ins2 /TPMGapdh))。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 単一細胞トランスクリプトーム データのバイオインフォマティクス解析します。(A) 管路のバイオインフォマティクス解析。(B) の読み取りすべての拠点間での品質スコアをシーケンスします。(C) 分布マップされたリード数。(D) 検出された遺伝子数の分布。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| コンポーネント | (Μ l) |
| 逆転写酵素 (200 U/μ L) | 0.5 |
| リボヌクレアーゼ阻害剤 | 0.25 |
| 最初繊維のバッファー (5 x) | 2 |
| DTT (100 mM) | 0.5 |
| ベタイン (5 M) | 2 |
| MgCl2 (1 M) | 0.06 |
| TSO (100 Μ M) | 0.1 |
| ヌクレアーゼ フリー水 | 0.29 |
| 合計 | 5.7 |
表 1: RT 試薬は、各サンプルの 5.7 μ L 反応のコンポーネントをミックスします。
| コンポーネント | (Μ l) |
| 最初繊維の反応 | 10 |
| DNA ポリメラーゼ (2 x ReadyMix) | 12.5 |
| PCR のプライマー (10 μ M) は、します。 | 0.25 |
| ヌクレアーゼ フリー水 | 2.25 |
| 合計 | 25 |
表 2: PCR 中古増幅試薬ミックス各サンプルの 25 μ L 反応のコンポーネント
| コンポーネント | (Μ l) |
| SYBR グリーン マスター ミックス | 5 |
| プライマー (5 μ M) | 0.5 |
| ヌクレアーゼ フリー水 | 2.5 |
| cDNA | 2 |
| 合計 | 10 |
表 3: qPCR 試薬標準 384 ウェル プレートを用いた 10 μ L 反応成分を混ぜます。
| コンポーネント | (Μ l) |
| 5 x TTBL | 1.6 |
| 2 ng cDNA | 変数 |
| ddH2O | 変数 |
| TTE ミックス V5 | 2 |
| 合計 | 8 |
表 4: Tagmentation 試薬は、各サンプルの 8 μ L 反応のコンポーネントをミックスします。
| コンポーネント | (Μ l) |
| ddH2O | 1.6 |
| 前のステップの製品 | 10 |
| 5 [x] タブ | 4 |
| N6XX | 2 |
| N8XX | 2 |
| 泰 | 0.4 |
| 合計 | 20 |
表 5: 濃縮 PCR 試薬のミックス コンポーネント サンプルごとに 20 μ L 反応。
| ステップ | 問題 | 可能性 | ソリューション |
| 1.3.4 | クランプのすべり | 間質液と collegenase leakness の少量の存在によって引き起こされる腸の外側の表面が濡れています。 | 十二指腸の壁と綿棒で腹腔内の他の臓器の壁を優しくスワップします。 |
| 1.3.6 | 腸バースト | 液体の圧力が腸で高すぎます。 | 射出速度を遅きます。 |
| 2.6 | 島を選ぶとき、島は膵外分泌組織に固執します。 | 不足して消化 | 消化期間および強度の揺れを長引かせる |
| 5.3 | PCR の拡大の後、cDNA 収量が低 | 悪い状態にあるセル | 新鮮なと良好な状態の細胞を保つ |
| 5.4 または 6.4 | プライマー二量体を見ることができます。 | 過剰なプライマー | 浄化の cDNA DNA 精製ビーズ (0.8: 1 または 1:1 の比率) と 1 つのより多くの時間 |
| 5.4 | PCR の拡大の後劣化 cDNA | セルまたは汚染された試薬の質の悪い | 良好な状態で細胞を保つまたは試薬を変更 |
| 6.3 | 図書館の建設後の DNA 量が低 | あまりにもいくつかの PCR サイクルまたは cDNA の品質はよくないです。 | サイクル数を増やすか、cDNA ライブラリ構築前に品質を確保します。 |
表 6: トラブルシューティングします。
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Discussion
このプロトコルでは、膵 β 細胞の単一細胞発現プロファイルを勉強するための効果的かつ簡単に使用できる方法を示した。このメソッドは、胎生期、新生児および生後の膵臓から内分泌細胞を分離し、単一細胞トランスクリプトーム解析が実行される可能性があります。
最も重要なステップは、良い状態の単一の β 細胞の分離です。完全に灌流膵臓より後続の消化に対応します。膵島の低収量で背側膵に発生します通常、不十分な循環になります。後、消化時間と揺れの強度には特に注意が必要です。過剰消化、積極的な長いインキュベーション時間から生じる揺れ、粉々 小島を破ることができます。不十分な消化完全に隣接する組織から小島を分離しません。膵臓の消化力の後、小島は密度勾配遠心法ではなく手摘みによって精製しました。密度勾配遠心法小島を豊かにすることができます、多くの小さな島または小島ゆかりの腺房組織が誤って破棄されます。腺房組織、非能率的なトリプシンの消化力を引き起こす可能性がありますと β 細胞の純度を減らすを選ぶようにしてください。
独立した生物の複製がある生物学的変動とバッチの効果を区別するために必要です。2 つの生物を複製 PCA で似たようなパターンがあるとクラスタ リング結果のようなサブグループが含まれて、これらのサンプルは、信頼性の高い生物学的変動を明らかにするかもしれない。それ以外の場合、追加の生物的複製は、結果を確認する必要があります。膵臓など代謝臓器の概日時計24に関連付けられたセル状態はバッチ違いを占める可能性があります。この問題を解決するためには、一日の同じ時間ですべてのサンプルの収集をお勧めします。
このアプローチの制限はスループットが低いセルごとにライブラリを構築しなければなりません。反応における過度のプライマーにより cDNA ライブラリ構築の前後に一般的にする必要がありますに浄化できる 2 回プライマー二量体を完全に削除します。これらのプロセスは時間がかかるです。最近では、修正されたプロトコル25程度にこの問題を解決できることが報告されました。このプロトコルでセル固有のバーコード ラベルの cDNA 断片を逆のトランスクリプション ステップの中に。したがって、各セルの cDNA 一緒にプールすることができ、精製し、図書館の建設が続きます。この変更は、図書館の建設のスループットを著しく増加します。ただし、この修正法は敏感であるし、セルごとの少数の遺伝子を検出します。また、このメソッドは減らされた読み取り範囲を持つメソッドをカウント ' 3 です。したがって、スマート seq2 はまだ膵臓の開発のための最も適切な方法です。
他の種からの膵臓の準備は、異なる場合があります。ひと膵臓の小島は、次の以前のプロトコル26,27分離できます。膵島単一細胞28に解離することができ、このメソッドを使用して単一細胞解析を実行します。このメソッドは、哺乳動物の膵臓の開発、疾患と再生の研究に広く適用することができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ライフ サイエンス コンピューティング プラットフォームを北京清華センター北京 (北京大学) 蛋白質科学のための国民の中心を感謝いたします。この作品は、省科学と中国の技術 (2015CB942800)、国家自然科学基金、中国の (31521004、31471358、および 31522036) と c. 高橋にライフ サイエンス北京清華センターからの資金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30VN-3' |
||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3' |
||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3' |
||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3' |
||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3' |
||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3' |
||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3' |
References
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A.
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).
- Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
- Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).
- Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
- Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).
- Hadley, W. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Springer Science & Business Media. (2009).
- Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. , Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. , (2017).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).
