Summary
Aquí describimos y comparamos dos posiciones para obtener la vista apical de cuatro cámaras en ratones. Estas posiciones permiten la cuantificación de la función ventricular derecha, proporcionan resultados comparables y se pueden utilizar indistintamente.
Abstract
La disfunción diastólica es una característica prominente de la remodelación del venticalismo derecho (RV) asociada con condiciones de sobrecarga de presión. Sin embargo, la función diastólica RV rara vez se cuantifica en estudios experimentales. Esto podría deberse a dificultades técnicas en la visualización de la RV en la vista apical de cuatro cámaras en roedores. Aquí describimos dos posiciones que facilitan la visualización de la vista apical de cuatro cámaras en ratones para evaluar la función diastólica RV.
La vista apical de cuatro cámaras se habilita inclinando la plataforma de fijación del ratón hacia la izquierda y caudalmente (LeCa) o hacia la derecha y el craneal (RiCr). Ambas posiciones proporcionan imágenes de calidad comparable. Los resultados de la función diastólica RV obtenidos de dos posiciones no son significativamente diferentes. Ambas posiciones son comparativamente fáciles de realizar. Este protocolo se puede incorporar a los protocolos publicados y permite investigaciones detalladas de la función RV.
Introduction
La disfunción diastólica es una característica prominente de la remodelación ventricular derecha (RV)1 y se asocia con condiciones de sobrecarga de presión2. Ecocardiografía (EchoCG) se puede utilizar para la caracterización de la disfunción diastólica RV3,4. A pesar de los recientes avances en la ecocardiografía animal pequeña, rara vez se notifican mediciones de parámetros diastólicos. Por el contrario, las mediciones de la función sistólica seutilizan ampliamente para la caracterización de ratones transgénicos 5, así como para la evaluación de una respuesta al tratamiento6.
Esto puede explicarse en parte por las dificultades en la medición de parámetros diastólicos desde la vista apical de cuatro cámaras. La visualización del corazón en esta posición se puede facilitar inclinando la plataforma de fijación LeCa o RiCr. Incluso si se utilizan estas manipulaciones, los ecocardiógrafos no las reportan en sus manuscritos4,7. Por lo tanto, sigue sin estar claro si estas manipulaciones proporcionan resultados comparables. Además, esto también impide el desarrollo de la nomenclatura estandarizada de esta posición para ratones.
El objetivo de este estudio fue describir dos posiciones para la visualización apical de vista de cuatro cámaras y comparar sus resultados. Para determinar las diferencias entre las dos posiciones, hemos utilizado el modelo de banda de arteria pulmonar de ratón (PAB), en el que un clip de tantalio conduce a una oclusión parcial de la arteria pulmonar. Esta oclusión da como resultado la remodelación del ventrículo derecho y la disfunción. Los detalles completos de la operación PAB se pueden encontrar en el trabajo publicado anteriormente3. Los ratones operados por Sham, donde el clip se colocó junto a la arteria pulmonar, se utilizaron para la comparación. Las investigaciones de EchoCG se realizaron tres semanas después de la operación utilizando el sistema de imágenes con un cabezal de exploración de 30 MHz (ver Tabla de Materiales para ambos). La nomenclatura para la descripción de las posiciones y orientaciones entre el ratón y el haz de ultrasonido se utiliza como se describe en Zhou et al.7.
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Protocol
El estudio se realizó de acuerdo con las normativas nacionales para la experimentación con animales y la Directiva 2010/63 de la UE. Preparar el equipo descrito anteriormente por Brittain et al.8.
1. Preparación del ratón
- Obtenga ratones C57Bl6/J masculinos de 12 a 13 semanas de edad y los aloje con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, a una temperatura ambiente constante y con acceso ad libitum a la comida de laboratorio estándar y al agua, hasta el inicio del experimento.
- Anestetizar el ratón usando anestesia general aprobada por el Instituto y comprobar la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo. Bajo anestesia leve con isoflurano 0.8%–1.2%, fijar el ratón en una plataforma calentada. Aplicar gel de electrodo a sus extremidades para el monitoreo continuo de su frecuencia cardíaca y temperatura.
- Depilar el pelo del pecho del ratón usando crema de depilación. Para reducir la presión sobre su tórax, no aplique el gel de acoplamiento de ultrasonido directamente en el tórax; más bien, aplicar una capa del gel a la punta del transductor.
2. Adquisición de imágenes
- Vista apical de cuatro cámaras con inclinación izquierda e caudal de la plataforma
- Después de la preparación del ratón, angula la plataforma hacia la izquierda a 10o–15o y luego caudalmente a 10o–15o.
- Coloque el transductor por encima del ápice con el plano de imagen de 45o al plano coronal y el eje central del haz de ultrasonido dirigido cranealmente, posterior y a la izquierda para obtener la vista apical de cuatro cámaras. Pulse el botón B-Mode para activar la imagen B-mode/2-D.
NOTA: El transductor se puede sujetar manualmente o fijar por una etapa. El término "modo B" proviene del sistema de imágenes que se utilizó en lugar del término más familiar "bidimensional" (2-D) y se utiliza en todo el protocolo. - Busque la apariencia de las siguientes estructuras en la ventana acústica: el ventrículo izquierdo (LV), la aurícula izquierda (LA), la RV, la aurícula derecha (RA), la válvula mitral (MV) y la válvula tricúspide (TV).
- Manipule el plano de imagen en el plano coronal y gire en el reloj y en sentido contrario a las agujas del reloj alrededor del eje central hasta que ambos ventrículos se visualicen en su dimensión más larga y ambas aurículas sean visibles. Esta es la vista de cuatro cámaras (Figura 1).
- Pulse el botón Cine store para guardar la grabación.
- Pulse el botón Escanear/Congelar para pausar el sistema.
- Medición de las velocidades del flujo sanguíneo ttriccúspide
- Pulse el botón Escanear/Congelar para activar el sistema.
- Pulse el botón Superponer varias veces para activar el volumen de muestra para el modo PW (onda pulsada).
- Mientras mantiene la vista de cuatro cámaras obtenida, utilice el trackball para colocar el volumen de la muestra en la apertura de las válvulas tricúspides para la medición de velocidades de entrada (velocidades máximas E y A).
- Pulse el botón de modo PW para medir las velocidades de entrada (velocidades máximas E y A).
NOTA: Debido a que las válvulas tricúspides son difíciles de visualizar en esta posición, realizar varias mediciones ayuda a alinear correctamente el volumen de la muestra con el flujo sanguíneo. Realice el muestreo Doppler con el ángulo de incidencia más pequeño entre el haz Doppler y la dirección del flujo sanguíneo. El perfil de flujo sanguíneo obtenido debe corresponder a los siguientes criterios: 1) un perfil de entrada similar a una forma de M con el primer pico inferior al segundo; 2) una modulación respiratoria con una mayor amplitud en la inspiración; 3) una amplitud máxima de velocidades en varias mediciones (Figura2). - Pulse el botón Cine store para guardar la grabación optimizada.
- Pulse el botón Escanear/Congelar para pausar el sistema.
- Medición de la excursión sistólica del plano anular tricúspide (TAPSE)
- Pulse el botón Escanear/Congelar para activar el sistema.
- Cambie al modo B pulsando el botón Modo B. Algunas manipulaciones en la imagen podrían ser necesarias para recuperar la vista correcta de cuatro cámaras.
- Pulse el botón Superponer varias veces para activar el volumen de muestra del modo M. Usando el trackball, alinee el volumen de la muestra con la parte lateral del anillo tricúspide. Tirando de los bordes del volumen de la muestra utilizando el trackball, alinee la longitud del volumen de la muestra para cubrir toda la amplitud del movimiento cardíaco durante el ciclo cardíaco.
- Pulse el botón Modo M para activar el modo M. Los movimientos del annulus tricúspide deben aparecer como una onda (Figura 2).
- Pulse el botón Cine store para guardar la grabación.
- Pulse el botón Escanear/Congelar para pausar el sistema.
- Medición de los parámetros Doppler de tejido
- Pulse el botón Escanear/Congelar para activar el sistema.
- Pulse el botón Modo B para activar el modo B.
NOTA: Algunas manipulaciones por angulación en el plano coronal y rotación en el reloj y en sentido contrario a las agujas del reloj alrededor del eje central de la imagen podrían ser necesarias para recuperar la vista correcta de cuatro cámaras. - Pulse el botón Superponer varias veces para activar el volumen de muestra para TDI (imágenes Doppler de tejido). Usando el trackball, alinee el volumen de la muestra con la parte lateral del anillo tricúspide, donde la pared libre de RV crea un ángulo con la válvula tricúspide. Tirando de los bordes del volumen de la muestra utilizando el trackball, ajuste el volumen de la muestra para incluir las posiciones extremas sistólicas y diastólicas del anillo.
-
Pulse el botón Tejido para activar el modo TDI.
NOTA: Aparece un trazado amarillo de la grabación TDI que corresponde a los siguientes criterios:1) una grabación similar a una forma M invertida; 2) picos Claramente distinguibles De' y A' durante la diástole y el pico S' durante la sístole; 3) una amplitud máxima de velocidades en varias mediciones (Figura2). - Pulse el botón Cine store para grabar una imagen optimizada.
- Pulse el botón Escanear/Congelar para pausar el sistema.
- Vista apical de cuatro cámaras con inclinación derecha y craneal de la plataforma
- Angula la plataforma a la derecha a 10o–15o y luego a craneal a 10o–15o. Realice las mediciones como se describe en las secciones anteriores para los pasos de LeCa (pasos 2.1, 2.2, 2.3 y 2.4).
NOTA: Durante la investigación, el isoflurano debe valorarse entre 0.–1.2 para mantener la frecuencia cardíaca del ratón en 400–440 bpm. En este rango, se pueden medir picos separados de flujo sanguíneo transtricúspide y velocidades de Doppler (DTI) tisulares. Para evitar los efectos de la pérdida de calor en la hemodinámica, los datos se registran y el análisis se realiza fuera de línea. Sólo se utilizan para el análisis las señales obtenidas al final de la expiración. Las mediciones de 3 - 5 latidos del corazón se promedian.
- Angula la plataforma a la derecha a 10o–15o y luego a craneal a 10o–15o. Realice las mediciones como se describe en las secciones anteriores para los pasos de LeCa (pasos 2.1, 2.2, 2.3 y 2.4).
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Representative Results
La vista apical de cuatro cámaras es difícil de obtener en ratones. Por lo tanto, las manipulaciones de la posición de la plataforma pueden ayudar a visualizar el corazón cambiando su posición en el tórax. La inclinación de la plataforma a la izquierda y a la derecha mejoró la ventana acústica y proporcionó imágenes de calidad comparable en modo B (Figura1). Después de obtener las posiciones correctas, las mediciones en los modos PW-, M- y TDI proporcionaron imágenes de calidad comparable (Figura2). La medición de los parámetros diastólicos se realizóen ratones gestionados por pab y falsos (Tabla 1). Ambas posiciones (RiCr y LeCa) dieron resultados similares en los parámetros diastólicos (Tabla 2). Además, las investigaciones de EchoCG en ambas posiciones revelaron diferencias similares entre los grupos de farsa y PAB (Tabla2,prueba de Dunnet). El análisis de correlación reveló un buen acuerdo entre los valores obtenidos de estas dos posiciones facilitadas (Figura3). Como pequeños grupos de animales se utilizaron para esteestudio, se han aplicado pruebas no paramétricas 9,10. La variabilidad intraobservadora para algunos parámetros analizados se ha publicado previamente3.
Figura 1 : Imágenes representativas de la vista apical de cuatro cámaras. La vista apical de cuatro cámaras se habilita inclinando la plataforma de fijación del ratón hacia la izquierda y caudalmente (LeCa) o hacia la derecha y el craneal (RiCr). LA - Aurícula izquierda; LV - ventrículo izquierdo; RA - aurícula derecha; RV - ventrículo derecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Imágenes representativas de las mediciones de flujo TAPSE, TDI y transtricúspide obtenidas de dos posiciones de visión apical de cuatro cámaras facilitadas. TAPSE - Excursión sistólica del plano del annulus tricúspide; E' - pico temprano de la velocidad de relajación ventricular derecha; A' - pico tardío de la velocidad de relajación ventricular derecha; S' - velocidad de la contracción ventricular derecha; E - pico temprano de afluencia tricúspide diastólica; Un pico tardío de afluencia tricúspide diastólica. Observe el cambio en el perfil de flujo sanguíneo transtricúspide en la inspiración (Insp). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis de correlación de datos obtenidos a partir de dos posiciones apicales facilitadas. El análisis de correlación se realizó utilizando la prueba no paramétrica de Spearman. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Caracterización de los grupos operados tres semanas después de la operación. RVFW - espesor de pared libre ventricular derecha; VTI: intervalo de tiempo de velocidad.
Tabla 2: Comparación de los resultados obtenidos de la vista apical de cuatro cámaras facilitada por la inclinación caudal izquierda o la plataforma craneal derecha. Se muestran los parámetros funcionales RV derivados de EchoCG. Como cada ratón fue investigado en ambas posiciones, la prueba wilcoxon de rango firmado se utilizó para las comparaciones intra-grupos. § p > 0,05 entre RiCr y LeCa. La prueba Kruskal-Wallis, seguida de la prueba post hoc de Dunnet, se utilizó para comparaciones de múltiples grupos. Los resultados de dos comparaciones entre grupos seleccionadas se presentan en la tabla. * p < 0.05, ** p < 0.01. PAB - bandas de arteriapulmonar; LeCa - inclinación caudal izquierda; RiCR - inclinación craneal derecha; E - pico temprano de afluencia tricúspide diastólica; Un pico tardío de afluencia tricúspide diastólica; TAPSE - Excursión sistólica del plano del annulus tricúspide; e' - pico temprano de la velocidad de relajación ventricular derecha; a' - pico tardío de la velocidad de relajación ventricular derecha; S' - velocidad de la contracción ventricular derecha; HR - frecuencia cardiaca; bpm - latidos por minuto.
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Discussion
La función de RV ecocardiográfica y la evaluación de dimensiones desde posiciones parasternales han sido bien descritas. Por el contrario, la posición apical en la ecocardiografía del ratón se ha descuidado en parte debido a dificultades técnicas. Utilizando una posición de plataforma horizontal, es difícil obtener una ventana acústica suficiente para imágenes de vista de cuatro cámaras. Para facilitar la toma de imágenes de esta posición, la plataforma se puede inclinar hacia la izquierda, una manipulación similar al posicionamiento del lado izquierdo de los pacientes. Esto debería resultar en un posicionamiento hacia la izquierda y más superior del corazón, mejorando así la ventana acústica. Por lo tanto, LeCa es nuestra posición estandarizada para la visualización apical. Sin embargo, en aproximadamente 30% –35% de los ratones, la calidad de imagen en esta posición puede ser insuficiente. Aquí, la imagen en la posición de RiCr puede ser útil.
A partir de estas posiciones, se pueden medir las velocidades de flujo sanguíneo transtricúspide (E y A) y las velocidades Doppler de tejido (E' y A'), proporcionando información sobre la función diastólica RV. Observamos una buena correlación entre los parámetros TDI obtenidos de las dos posiciones. Menos satisfactoria fue la correlación de E. En general, la visualización del perfil de flujo sanguíneo transtricúspide fue la parte más desafiante del protocolo presentado aquí y exhibió la mayor variabilidad. La medición de TAPSE y S' por tejido Doppler proporcionó una estimación de la función sistólica RV. Sin embargo, a la luz de los hallazgos recientes, el significado fisiológico de TAPSE no está claro11. No medimos rutinariamente el área fraccionaria RV de contracción de la posición apical porque, en las condiciones de sobrecarga de presión, laparte lateral de la RV ampliada está parcialmente cubierta por el esternón y no es completamente visible desde esta posición 3. Así, la visualización de la posición apical en ratones permite la medición de los parámetros utilizados rutinariamente en la clínica y, por lo tanto, proporciona más información, lo que permite una caracterización funcional más completa.
La tensión, el análisis de la tasa de tensión y la ecocardiografía de seguimiento de motas son modalidades novedosas del ultrasonido cardíaco12. Su alta sensibilidad puede detectar la disfunción cardíaca en las etapas iniciales13 y tiene el poder de predecir la mortalidad14; por lo tanto, su aplicación también está justificada en estudios experimentales. Desafortunadamente, en ratones, la pared libre de RV está parcialmente oculta detrás de la sombra del esternón, lo que podría dificultar el análisis de la tensión. Además, el análisis de manchas requiere una buena calidad de imagen y visualización de toda la pared libre.
El sistema cardiovascular responde rápidamente a los cambios en la postura activando los mecanismos de barorreceptor15. Por lo tanto, se podría esperar que la inclinación craneal de la plataforma causaría cambios de reflectoren en los parámetros cardíacos medidos. De hecho, tanto la posición de inclinación de cabeza hacia arriba como la posición de inclinación de cabeza hacia abajo causaron un cambio transitorio en la frecuencia cardíaca y el eje eléctrico cardíaco en ratones16. Mientras que una inclinación de 90o hacia arriba causa un aumento de la frecuencia cardíaca, una inclinación de cabeza hacia abajo de 90o causó bradicardia transitoria y estadísticamente insignificante. Por el contrario, se recomienda inclinar el ratón sólo entre 10o y 15o en cualquier dirección. Estos cambios leves en la postura no causaron perturbaciones hemodinámicas medibles.
La función diastólica del VI en ratones es otra zona poco estudiada. Aunque no se ha probado en este estudio, el protocolo presentado aquí debe poder utilizarse para la cuantificación de la función diastólica del VL.
Las limitaciones teóricas y prácticas del pequeño animalEchoCG se han descrito en detalle en otros lugares 8. En este protocolo, las mediciones se realizan a frecuencias cardíacas de 400–440 bpm. En este rango de frecuencia cardíaca, las mediciones de los picos de velocidad E y A, así como de los índices TDI, son factibles. A frecuencias cardíacas más altas, los picos se fusionan, haciendo imposible la cuantificación. Dado que la frecuencia cardíaca fisiológica para ratones es de 500–600 bpm, la frecuencia cardíaca utilizada en este protocolo es bastante baja. Sin embargo, las mediciones en este rango de frecuencia cardíaca parecen fiablesy permiten distinguir entre fenotipos fisiológicos y disfuncionales 3.
Hemos descrito un protocolo para dos posiciones que facilita la evaluación de los parámetros funcionales de RV a partir de vistas de cuatro cámaras en ratones. Las posiciones proporcionan resultados comparables y se pueden utilizar indistintamente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El estudio fue financiado por el Instituto Ludwig Boltzmann para la Investigación Vascular Pulmonar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RMV-707B scan head 30 MHz | Visual Sonics | P/N 11459 | mouse scan head |
| VisualSonics Vevo 770® High-Resolution Imaging System | Visual Sonics | 770-230 | ultrasound machine |
| Veet depilation creme for sensitive skin | Veet | 07768307 | |
| Surgical tape Durapore 3M | 3M Deutschland GmbH | 1538-1 | for fixation |
| Askina Brauncel cellulose swabs | B.Braun | 9051015 | |
| Aquasonic ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | BT025-0037L | |
| Electrode Gel | GE medical systems information technologies Inc. | 2034731-002 | apply to extremities for countinous ECG and heart rate monitoring |
| Thermasonic gel warmer | Parker Laboratories Inc. | 82-04-20 | to reduce heat loss warm up the ultrasound gel before use |
References
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