Maintien des Cultures biologiques et mesurer l’Expression des gènes dans l’Aphis nerii: un système Non-modèle pour les Interactions plantes-insectes
Summary
Le puceron Aphis nerii colonise fortement défendues de plantes de la famille (Apocyanaceae) et offre de nombreuses possibilités pour étudier les interactions plantes-insectes. Nous présentons ici une série de protocoles pour l’entretien des plantes et des pucerons, cultures et la génération et l’analyse de moléculaire et données – omic pour a. nerii.
Abstract
Les pucerons sont excellents modèles expérimentaux pour une variété de questions biologiques allant de l’évolution des symbioses et le développement de polyphenisms aux questions entourant les interactions avec leurs plantes hôtes de l’insecte. Ressources génomiques sont disponibles pour plusieurs espèces de pucerons, et grâce aux progrès dans le séquençage de nouvelle génération, transcriptomique études sont étendus pour les organismes non-modèle qui manquent de génomes. En outre, cultures de pucerons soient collectées sur le terrain et élevés en laboratoire pour l’utilisation dans des expériences organismiques et moléculaires pour combler l’écart entre les études écologiques et génétiques. Enfin, beaucoup de pucerons peuvent être maintenus en laboratoire sur leurs plantes hôtes préférés dans le cycle de vie perpétuel, parthénogénétiques permettant des comparaisons de reproduction asexuée des génotypes. Aphis nerii, le puceron de l’asclépiade-lauriers roses, fournit un tel modèle pour étudier les insectes interactions avec des plantes toxiques à l’aide d’expériences moléculaires et organismiques. Méthodes pour la génération et l’entretien des cultures végétales et puceron dans l’expression différentielle de serre et en laboratoire, extractions d’ADN et d’ARN, l’analyse de microsatellites, Assemblée de transcriptome de novo et annotation, transcriptome l’analyse et la vérification de qPCR de gènes différentiellement exprimés sont décrites et discutées ici.
Introduction
Les pucerons sont de petits insectes hémimétaboles qui colonisent sur des familles de diverses plantes dans le monde entier. Ils sont distinguent par plusieurs caractéristiques, plus notamment leurs cycles de vie complexes impliquant la parthénogénèse cyclique et polyphenisms discrets et leurs symbioses nutritionnelles obligatoires avec endosymbiontes bactérie ou levure qui fournissent des éléments nutritifs manquant à partir leur alimentation d’usine sap1. Alors que la plupart des pucerons sont des spécialistes de plante hôte, certaines espèces généralistes sont des ravageurs de culture importante, infligeant des dégâts économiques considérables sur les cultures soit directement ou via les agents pathogènes et les virus ils vector2. La publication du premier génome du puceron en 2010, du puceron du pois Acyrthosiphon pisum3, a marqué un jalon important dans l’étude de la biologie de pucerons parce qu’il a fourni les ressources génomiques pour répondre aux questions au sujet de l’insecte adaptations pour les herbivores des modes de vie, y compris celles qui pourraient conduire à un meilleur contrôle des stratégies4. Depuis ce temps, des ressources supplémentaires de génomiques ont accumulé avec la publication d’un génome annoté pour le soja puceron Aphis glycines5et ressources accessibles tout le génome d’une autre espèce de trois-puceron (Myzus Cerasi (black cherry aphid), Myzus persicae (pêche-pomme de terre pucerons), Rhopalosiphum padi (cerisier des oiseaux-puceron)6. Ressources de transcriptomique précieux de novo sont disponibles aussi bien pour un certain nombre d’autres espèces de pucerons (e.g.,Aphis gossypii (puceron du cotonnier)7, Sitobion avenae (puceron des céréales)8, Cinara pinitabulaeformis (puceron du pin)9, Aphis nerii (puceron asclépiade-laurier-rose)10).
Les pucerons ont également une contribution durable à notre compréhension des interactions plantes-insectes et l’écologie de la vie sur plantes11. Un domaine où les pucerons ont apporté une contribution particulièrement importante est dans notre compréhension de l’écologie chimique des interactions plante hôte. Des adaptations expriment divers insectes herbivores pour vaincre les défenses végétales et certains même coopter des défenses de la plante pour leur propre bonheur12,13,14. Par exemple, le puceron de l’asclépiade-lauriers roses, Aphis nerii, est un brillant jaune, invasif puceron trouvé dans les régions tempérées et tropicales partout dans le monde qui colonise les plantes de la famille des asclépiades (Apocynaceae). Plantes de la famille des Apocynaceae ont évolué des défenses chimiques diverses, y compris le latex laiteux et des glucosides cardiotoniques, appelées cardénolides, qui lient le transporteur de cations Na, K-ATPase et sont des moyens de dissuasion efficaces au généraliste herbivores15, 16. spécialistes asclépiade expriment différents modes de résistance aux cardénolides, et certains sélectivement ou passivement accumulent ou modifient des cardénolides dans leurs tissus comme un moyen de dissuader les prédateurs ou d’autres avantages17. A. nerii est pensé pour séquestrer cardénolides de cette façon, même si les mécanismes et les avantages fonctionnels demeurent peu claires10,18.
Compte tenu des ressources génomiques à portée de main, a. nerii fournit un excellent modèle expérimental pour l’étude des mécanismes moléculaires et génétiques impliqués dans les interactions entre plantes hôtes toxiques et leur spécialiste chimio-écologiques herbivores. Il est à noter que, tandis que certains des premières études de a. nerii axé sur la séquestration des cardénolides19, depuis ce temps, études d’a. nerii ont permis de mieux comprendre un large éventail de questions écologiques et évolutionnaires, y compris la structure génétique des insectes envahissants20 et l’interaction entre la réglementation ascendantes et descendantes sur les herbivores densité21. A. nerii est donc un bon candidat comme modèle expérimental pour un ensemble particulièrement large d’études des interactions plantes-insectes. Critique au succès de toute étude avec a. nerii est la culture attentive du puceron des populations, qui comprend la culture des plantes dont dépendent les pucerons, mais aussi à une production efficace des données de haute qualité – omic. Notre but est de guider le lecteur à travers les deux. Décrites ci-dessous sont des méthodes pour la génération et l’entretien des cultures végétales et pucerons dans la serre et laboratoire, ADN et ARN extractions, analyses microsatellites, Assemblée de transcriptome de novo et annotation, transcriptome analyse de l’expression différentielle et la vérification de qPCR de gènes différentiellement exprimés. Alors que ces méthodes soient écrits pour a. nerii, les méthodes de culture, d’extraction et analyse générales peuvent étendre à un éventail d’espèces de pucerons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il a longtemps été reconnu que l’aposématiques nerii a. peut apporter un éclairage sur les modèles et les mécanismes de résistance aux défenses de la plante et particulièrement chimique séquestration du18,37. Un certain nombre de ressources génomiques ont récemment émergé pour a. nerii10, offrant de nouvelles possibilités pour des études de génomique écologiques et fonctionnels qui utilisent nerii …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Michelle Moon (Vanderbilt University) pour une assistance avec la photographie. Soutien de l’Université Vanderbilt fourni PA et SSLB est pris en charge par DGE-1445197.
Materials
| Sun Gro Fafard Germination Mix | Hummert International | 10-0952-2 | |
| Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix | Hummert International | 10-0951-2 | |
| 2x 4" Round Standard Pot | Anderson Pots | 1503 | |
| DreamTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0701 | |
| Trizol | ThermoFisher Scientific | 15596026 | |
| SuperScript® III First-Strand Synthesis kit | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4367659 |
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