Manutenção de culturas biológicas e medição de expressão gênica em Aphis nerii: um sistema Non-modelo de interações inseto-planta
Summary
O pulgão Aphis nerii coloniza altamente defendido das plantas pertencente à família (Apocyanaceae) e oferece inúmeras oportunidades para estudar interações inseto-planta. Aqui, apresentamos uma série de protocolos para a manutenção da planta e pulgão, culturas e a geração e análise molecular e – omic dados pela . nerii.
Abstract
Pulgões são excelentes modelos experimentais para uma variedade de questões biológicas, desde a evolução da simbiose e o desenvolvimento de polyphenisms a questões em torno as interações do inseto com suas plantas hospedeiras. Genômica recursos estão disponíveis para várias espécies de afídeos, e com os avanços no próxima geração de sequenciamento, transcriptomic estudos estão sendo estendidos para os organismos que não possuem genomas não-modelo. Além disso, culturas de pulgão podem ser coletadas do campo e criadas em laboratório para uso em experimentos de organismos e moleculares para colmatar o fosso entre os estudos ecológicos e genéticos. Por último, muitos pulgões podem ser mantidos no laboratório em suas plantas hospedeiras preferenciais perpétuos, parthenogenic ciclos de vida, permitindo comparações de genótipos assexuadamente. Aphis nerii, o pulgão da serralha-Oleandro, fornece um modelo deste tipo para estudar interações insetos com plantas tóxicas, usando as experiências dos e moleculares. Métodos para a geração e manutenção das culturas vegetais e pulgão na estufa e laboratório, extrações de DNA e RNA, análise de microssatélites, novo de transcriptoma montagem e anotação, transcriptoma expressão diferencial análise e verificação de qPCR de genes diferencialmente expressos são descritos e discutidos aqui.
Introduction
Pulgões são insetos pequenos, hemimetabólicos que colonizam em famílias de diversas plantas em todo o mundo. Eles são distintos para vários recursos, mais notavelmente seus ciclos de vida complexos envolvendo partenogênese cíclica e polyphenisms discreta e sua simbiose nutricional obrigatórios com endossimbiontes bacterianos ou levedura que fornecem nutrientes faltando sua dieta da seiva de planta1. Enquanto a maioria dos pulgões são especialistas em planta de acolhimento, algumas espécies generalistas são pragas de cultura importante, infligindo danos económicos consideráveis nas culturas ou diretamente ou por meio dos agentes patogénicos e vírus eles vetor2. A publicação do primeiro genoma de pulgão em 2010, o pulgão ervilha pisum piolho3, marcado um marco importante no estudo da biologia de afídio porque forneceu os recursos genômicos para abordar questões sobre do inseto adaptações para os herbívoros estilos de vida, incluindo aqueles que possam levar a um melhor controle de estratégias4. Desde aquela época, recursos adicionais de genômicos acumularam-se com a publicação de um genoma anotado para o pulgão de soja glycines Aphis5e recursos do genoma inteiro publicamente disponíveis para outro afídio-três espécies (Myzus Cerasi (cereja preta afídio), Myzus persicae (pulgão da batata-pêssego), Rhopalosiphum padi (pulgão Azereiro-aveia)6. Valioso de novo transcriptomic recursos estão disponíveis, bem como para um número de outras espécies de pulgão (e.g.,Aphis gossypii (pulgão do algodão)7, Sitobion avenae (afídio grão)8, Cinara pinitabulaeformis (afídio pinho)9, Aphis nerii (pulgão da serralha-oleandro)10).
Pulgões também fizeram contribuições duradouras para nossa compreensão de interações inseto-planta e a ecologia da vida em plantas11. Uma área onde os pulgões fizeram contribuições particularmente importantes é em nossa compreensão da ecologia química nas interações planta do anfitrião. Expressa diversas adaptações de insetos herbívoros para superar as defesas da planta e alguns até mesmo cooptam defesas vegetais para seu próprio beneficiam12,13,14. Por exemplo, o pulgão da serralha-Oleandro, Aphis nerii, é um brilhante amarelo, invasivo pulgão encontrado em regiões temperadas e tropicais do mundo que coloniza em plantas da família serralha (Apocynaceae). Plantas da família Apocynaceae evoluíram diversas defesas químicas, incluindo látex leitoso e glicosídeos cardíacos, conhecidos como cardenolides, que ligam o transportador de cátion Na, K-ATPase e eficaz dissuasiva para generalista herbívoros15, 16. especialistas milkweed expressam vários modos de resistência ao cardenolides, e alguns seletivamente ou passivamente se acumulam ou modificar cardenolides em seus tecidos, como um meio de impedir a predação ou para outros benefícios de17. A. nerii é pensado para sequestrar cardenolides desta forma, embora os mecanismos e benefícios funcionais permanecem pouco claras10,18.
Tendo em conta os recursos genômicos em mãos, a. nerii fornece um excelente modelo experimental para o estudo dos mecanismos moleculares e genéticos envolvidos nas interações quimio-ecológicas entre plantas hospedeiras tóxicos e seu especialista herbívoros. É interessante notar que, enquanto alguns dos primeiros estudos de a. nerii focada em sequestro de cardenolides19, desde aquela época, estudos da . nerii forneceram introspecções em um amplo conjunto de questões evolutivas e ecológicas, incluindo a estrutura genética de insetos invasiva20 e a interação entre ascendente e descendente de regulamento sobre o herbívoro densidade21. A. nerii , portanto, é um bom candidato como modelo experimental para um especialmente amplo conjunto de estudos das interações inseto-planta. Crítico para o sucesso de qualquer estudo com a. nerii é a cultura cuidadosa de afídio populações, que inclui a cultura de plantas de que dependem os pulgões, assim como uma geração eficiente de dados de alta qualidade – omic. Nosso objetivo é orientar o leitor através de ambos. Descritos abaixo são os métodos para a geração e a manutenção das culturas vegetais e pulgão na estufa e laboratório, DNA e RNA extrações, análise de microssatélites, de novo transcriptome montagem e anotação, transcriptoma análise da expressão diferencial e qPCR verificação de diferencialmente expressos genes. Enquanto esses métodos são escritos pela . nerii, os métodos de cultivo, extração e análise gerais podem estender a uma variedade de espécies de pulgão.
Protocol
Representative Results
Discussion
Há muito tempo foi reconhecido que o aposemático a. nerii pode fornecer insights sobre os padrões e mecanismos de resistência às defesas vegetais e sequestro particularmente química18,37. Um número de recursos genômicos surgiram recentemente para a. nerii10, oferecendo novas oportunidades para estudos de genômicas funcionais e ecológicas que usam a. nerii como um modelo. Nós esboçamos protocolos bási…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Michelle Moon (Vanderbilt University) para obter assistência com a fotografia. Universidade de Vanderbilt fornecido suporte para PA e SSLB é suportada pela DGE-1445197.
Materials
| Sun Gro Fafard Germination Mix | Hummert International | 10-0952-2 | |
| Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix | Hummert International | 10-0951-2 | |
| 2x 4" Round Standard Pot | Anderson Pots | 1503 | |
| DreamTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0701 | |
| Trizol | ThermoFisher Scientific | 15596026 | |
| SuperScript® III First-Strand Synthesis kit | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4367659 |
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