정 맥 및 양수 내 Utero Murine 모델에 이식
Summary
우리는 murine 모델에 주입의 정 맥 및 양수 내 노선을 통해는 utero에 이식 (IUT)을 수행 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 독특한 면역 관용 태아 환경에 셀, 바이러스 성 벡터, 및 다른 물질을 소개 하는 것이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.
Abstract
이식 (IUT) utero에서 의 치료는 임신 초기에 줄기 세포, 바이러스 성 벡터, 또는 다른 물질을 소개 하는 데 사용할 수 있는 독특하고 다양 한 모드입니다. 치료 목적 IUT 뒤에 근거는 태아, 태아 면역학 미 숙, 접근성 및 태아 줄기 또는 조상 세포 및 질병을 치료 하는 잠재력의 증식 특성 또는 증상의 작은 크기에 따라 이전에 출생. 필요 없이 낫 세포 질병 등 선 천 성 혈액 질환을 치료 하는 한 IUT 태아, 조 혈 줄기 세포 (HSC) 을 통해 전달의 이러한 정상적인 발달 속성의 활용 myeloablative 또는 출생 후 HSC 이식에 필요한 면역 조절. 마찬가지로, 개발 하는 동안 여러 장기에 조상 세포의 접근성은 잠재적으로 줄기/시 조 세포 유전자 치료 또는 게놈 편집과 바이러스 성 벡터의 IUT 다음의 보다 효율적인 타겟팅에 대 한 수 있습니다. 또한, IUT 포함 하 여, 정상적인 발달 과정을 연구 하는 데 사용 수 있지만, 면 역학적 관용의 개발에 국한 되지 않습니다. Murine 모델 잠재력과 전 임상 큰 동물 연구와 최종 임상 응용 프로그램 전에 IUT의 한계를 이해 하는 데 귀중 한 하 고 저렴 한 방법을 제공 합니다. 여기, 우리는 정 맥 및 양수 내 경로 통해 murine 태아의 한 IUT 수행을 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 명료 하 게 하는 필요 조건 및 조 혈 줄기 세포 이식 utero에서 , 관용 유도, 그리고 유전자 치료 utero에서 뒤에 메커니즘을 성공적으로 사용 되었습니다.
Introduction
태아 검사 및 진단의 최근 발전 태아 선 천 성 장애는 적절 한 산 후 치료 옵션 없고 중요 한 병 적 상태와 사망률의 수에 대 한 치료의 가능성을 빛을 가져왔다. 특히, utero에서 조 혈 줄기 세포 이식 (IUHCT) 및 유전자 치료/게놈 편집가지고 혈액, 면역, 그리고 유전자 치료 선 천 성 태아의 정상적인 발달 속성의 활용 가능성 출생 후 HSC 이식 및 유전자 치료/게놈 편집1,2를 할 수 있는 것 보다 더 효율적으로 장애. 특히, 태아의 작은 크기로 인해 기증자 셀 또는 바이러스 성 벡터 복용량 수 극대화 할 받는 사람의 무게 당. 또한, 태아의 면역학 미 숙 기증자 HSCs 없이 myeloablative 및 면역 조절 주사 하 산 후 이식 프로토콜에 필요한 수 있습니다. 마찬가지로, 치료 transgene 또는 게놈 편집 기술 바이러스 성 벡터는 transgene 제품 또는 바이러스 성 벡터에 대 한 제한 면역 응답 없이 주입 수 있습니다. 마지막으로, 접근성 및 태아 줄기/뿌리 세포의 증식 특성 줄 보다 효율적인 변환 대상 조상 세포의 게놈 편집 (homology 감독 수리)의 자전거 필요로 하는 특정 모드의 가능성 효율적으로 발생 하는 셀. Murine 모델 줄기 세포 생물학과 면역학 큰 전 임상 동물 모델에서 실험 이전에 중요 한 질문을 해결 하는 통찰력과 저렴 한 수단으로 제공 하 고, 따라서, IUHCT 및 utero에서 기본 모델 역임 했다 유전자 치료 탐험된1,2,3되었습니다.
많은 변수는 IUHCT 및 utero에서 유전자 치료/게놈 편집 murine 크고 동물 모델에서의 성공에 중요 한 역할을, 비록 주요 변수 HSCs 또는 바이러스 성 벡터의 납품의 방법입니다. 태아 간, IUHCT의 때에 조 혈 기관에에서 발생 하는 1 차 통과 효과 함께 기증자 HSCs의 큰 복용량의 납품 engraftment 마우스 및 큰 동물 모델4 macrochimeric 수준의 달성에 도움이 될 표시 되었습니다. ,5. 이것 달성을 통해 통해 개 모델에서 내 심장 주입 및 기증자 세포를 통해 마우스 모델에서 vitelline 정 맥 주사 했다. 주입의 경로 또한 개발 하는 동안 다른 장기의 조상 세포를 타겟팅에서 근본적인 역할을 하고있다. 예를 들어 한 정 맥 주사 를 통해 vitelline 정 맥 효율적으로 transduce cardiomyocytes와 늦은 임신 주입6,7다음 hepatocytes에 표시 되었습니다. 또는, 바이러스 성 벡터의 양수 내 주사 주입8시간에 배아 접는/개발에 따라 물리적으로 노출 되는 장기를 대상으로 수 있습니다. 이 최고의 활용 운동의 정상적인 태아 “호흡”, 바이러스 성 벡터에는 양수를 호흡기 노출 임신에서 양수 내 주입을 통해 호흡기 상피의 대상으로 궁 행 유체9. IUT, 정 맥을 통해 vitelline 정 맥의 이러한 두 가지 모드와 양수 내, 우리의 실험실에서 여러 과거와 지속적인 실험에 대 한 기초가 되었습니다. 이 프로토콜에서 우리가 자세히 murine 모델에 정 맥 및 양수 내 IUT를 수행 하기 위한 방법을 설명 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이식 utero에서 임신 초기에 진단 될 수 있는 많은 선 천 성 질환에 대 한 잠재적인 치료 이다. IUT는 murine 모델 연구를 태아 환경을 탐구 하 또는 다른 치료와 함께 실험을 수 있습니다. 주입 되 고 타겟이 되 고에 따라 정 맥 또는 양수 내 utero에 이식 원하는 공간으로는 injectant의 안정적인 납품을 제공할 수 있습니다.
특정 장기를 대상으로, 그것은 주입 기술 뿐 아?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
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