Intravenosa e Intra-amniótica no Utero transplante no modelo murino
Summary
Descreveremos um protocolo para a realização de um transplante no utero (IUT) através de vias intravenosa e intra-amniótica de injeção no modelo murino. Este protocolo pode ser usado para introduzir células, vetores virais e outras substâncias em único ambiente fetal imune-tolerantes.
Abstract
Transplante de in utero (IUT) é um modo único e versátil de terapia que pode ser usado para introduzir células-tronco, vetores virais ou quaisquer outras substâncias no início da gestação. A lógica por trás de IUT para fins terapêuticos baseia-se o pequeno tamanho do feto, a imaturidade imunológica fetal, a acessibilidade e natureza proliferativa de células estaminais ou progenitoras fetais e o potencial para tratar uma doença ou do início dos sintomas antes do nascimento. Aproveitando essas propriedades no desenvolvimento normais do feto, a entrega de células-tronco hematopoiéticas (HSC) através de uma IUT tem o potencial para tratar doenças hematológicas congénitas, tais como a doença falciforme, sem a necessária transplantes de mieloablativo ou imunossupressora condicionamento necessário para HSC pós-natal. Da mesma forma, a acessibilidade de células progenitoras em múltiplos órgãos, durante o desenvolvimento potencialmente permite um direcionamento mais eficiente de células tronco/progenitoras seguindo uma IUT de vetores virais para terapia do gene ou genoma de edição. Além disso, IUT pode ser usado para estudar os processos normais de desenvolvimento incluindo, mas não se limitando a, o desenvolvimento da tolerância imunológica. O modelo murino fornece um meio valioso e acessível para entender o potencial e as limitações da IUT antes da pré-clínicos estudos animais grandes e uma eventual aplicação clínica. Aqui, descrevemos um protocolo para a realização de uma IUT no feto através de vias intravenosa e intra-amniótica murino. Este protocolo tem sido usado com sucesso para elucidar as condições necessárias e mecanismos subjacentes no utero o transplante de células-tronco hematopoiéticas, indução de tolerância e no utero terapia de gene.
Introduction
Recentes avanços no diagnóstico e rastreio pré-natal tem trazido à luz da possibilidade de tratar o feto para um número de doenças congênitas que não tem as opções de tratamento pós-natal adequada e resultar em significativa morbidade e mortalidade. Especificamente, no utero o transplante de células-tronco hematopoiéticas (IUHCT) e edição de terapia/genoma gene têm potencial para tirar proveito das propriedades do desenvolvimento normais do feto para tratar doenças congênitas hematológica, imune e genética os transtornos mais eficientemente do que o transplante de HSC pós-natal e edição de genoma/terapia do gene podem fazer1,2. Especificamente, devido ao pequeno tamanho do feto, a célula do doador ou dose de vetor viral pode ser maximizado pelo peso do destinatário. Além disso, a imaturidade imunológica do feto permite doadores de linfócitos deve ser injetado sem a mieloablativo e imunossupressoras condicionamento que é exigido nos protocolos de transplante pós-natal. Da mesma forma, carregando um transgene terapêutico ou tecnologia de edição de genoma de vetores virais podem ser injetados sem uma resposta imune limitante para o transgene produto ou o vetor viral. Finalmente, a acessibilidade e a natureza proliferativa de células tronco/progenitoras fetais pagar a possibilidade de uma mais eficiente transdução de células progenitoras de destino, bem como certos modos de genoma edição (dirigido por homologia reparação) que necessitam de ciclismo células ocorra de forma eficiente. O modelo murino serve como um meio perspicaz e acessível para abordar questões importantes em biologia de células-tronco e Imunologia antes de fazer experiências em modelos pré-clínicos de animais grandes e, como tal, tem servido como o modelo principal em que IUHCT e no útero terapia genética têm sido exploradas1,2,3.
Apesar de muitas variáveis desempenham um papel importante no sucesso de IUHCT e no utero gene terapia/genoma edição em modelos animais murino e grandes, uma variável-chave é o método de entrega dos linfócitos ou vetor viral. A entrega de grandes doses de linfócitos de doadores com um efeito de primeira passagem ocorra no fígado fetal, o órgão hematopoiético aquando do IUHCT, foi mostrada para ser instrumental na obtenção de níveis de macrochimeric de enxertia em mouse e modelos animais grandes4 ,5. Isto foi conseguido através de uma injeção de doador células através da veia vitelínico no modelo de rato e através de uma injeção intra cardíaca no modelo canino. A rota de injeção também desempenha um papel fundamental no direcionamento de células progenitoras de órgãos diferentes durante o desenvolvimento. Por exemplo, uma injeção intravenosa através da veia vitelínico tem demonstrada eficientemente transduce cardiomyocytes e hepatócitos após um final de gestação injeção6,7. Alternativamente, uma injeção intra-amniótica de vetores virais permite a segmentação dos órgãos que estão expostos fisicamente baseados no dobradura/desenvolvimento embrionário no momento da injeção8. Isto é melhor exemplificado pela segmentação do epitélio respiratório através de uma injeção intra-amniótica no final da gestação para aproveitar normal “respirar” movimentos fetais, que expõe o trato respiratório para o vetor viral no amniótico fluido de9. Estes dois modos de IUT, por via venosa através da veia vitelínico e intra-amniótica, foram a base para várias experiências passadas e em curso no nosso laboratório. Neste protocolo, descrevemos em detalhe os métodos para a realização de IUT intravenosa e intra-amniótica no modelo murino.
Protocol
Representative Results
Discussion
No útero o transplante é uma terapia potencial para muitas desordens congênitas que pode ser diagnosticada no início da gestação. O modelo murino de IUT permite que os pesquisadores para explorar o ambiente fetal ou para experimentar com diferentes terapias. Dependendo do que está sendo injetado e o que está sendo invadido, por via venosa ou intra-amniótica no utero transplante pode fornecer uma entrega confiável de um injectant para o espaço desejado.
Quando o dir…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
References
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
- Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).
- Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).
- Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).
- Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).
- Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
- Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).
- Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).
- Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
- Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).
- Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).
- Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
- Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
- Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).
