Endovenosa e Intra-amniotic nell'Utero trapianto nel modello murino
Summary
Descriviamo un protocollo per l’esecuzione di un trapianto in utero (IUT) attraverso vie endovenosa e intra-amniotic di iniezione nel modello murino. Questo protocollo consente di introdurre cellule, vettori virali e altre sostanze nell’unico ambiente fetale immunitario-tollerante.
Abstract
Il trapianto in utero (IUT) è un modo unico e versatile di terapia che può essere utilizzato per introdurre le cellule staminali, vettori virali o altre sostanze all’inizio della gestazione. La spiegazione razionale dietro IUT a scopo terapeutico è basata sulle piccole dimensioni del feto, l’immaturità fetale immunologica, l’accessibilità e la natura proliferativa delle cellule staminali o progenitrici fetale e il potenziale di trattare una malattia o l’insorgenza di sintomi prima della nascita. Approfittando di queste proprietà inerente allo sviluppo normale del feto, la fornitura di cellule staminali ematopoietiche (HSC) tramite un IUT ha il potenziale per il trattamento di disordini congeniti ematologici quali anemia falciforme, senza la necessaria i trapianti mieloablativa o immunosoppressiva condizionata necessaria per HSC postnatale. Allo stesso modo, l’accessibilità delle cellule progenitrici in organi multipli durante lo sviluppo potenzialmente permette per un targeting più efficiente delle cellule staminali/progenitrici dopo un IUT di vettori virali per la terapia genica o editing genomico. Inoltre, IUT può essere usato per studiare i processi inerenti allo sviluppo normali tra cui, ma non limitato a, lo sviluppo di tolleranza immunologica. Il modello murino fornisce un mezzo prezioso e conveniente per comprendere le potenzialità e le limitazioni di IUT prima studi pre-clinici di animali grandi e un’eventuale applicazione clinica. Qui, descriviamo un protocollo per l’esecuzione di un IUT nel feto murino attraverso vie endovenosa e intra-amniotic. Questo protocollo è stato usato con successo per delucidare i meccanismi dietro nell’utero il trapianto di cellule staminali ematopoietiche, induzione della tolleranza e la terapia genica nell’utero e le condizioni necessarie.
Introduction
Recenti progressi nella diagnosi e lo screening prenatale hanno portato alla luce la possibilità di trattare il feto per un certo numero di disordini congeniti che non hanno opzioni di adeguato trattamento postnatale e provocare la morbosità e mortalità significative. In particolare, nell’utero il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (IUHCT) e la modifica di gene terapia/genoma hanno il potenziale per approfittare delle proprietà inerente allo sviluppo normale del feto per trattare congenita ematologica, sistema immunitario e genetico i disordini più efficientemente postnatale trapianto di HSC e gene terapia/genoma modifica può fare1,2. In particolare, a causa delle piccole dimensioni del feto, la cellula donatrice o dose di vettore virale può essere ingrandita per il peso del destinatario. Inoltre, l’immaturità immunologica del feto consente donatore HSCs per essere iniettato senza il mieloablativa e immunosoppressiva condizionata che è necessaria in protocolli di trapianto postnatale. Allo stesso modo, vettori virali che trasportano un transgene terapeutico o la tecnologia di editing del genoma possono essere iniettati senza una risposta immunitaria limitante per il prodotto di transgene o il vettore virale. Infine, l’accessibilità e la natura proliferativa delle cellule embrionali staminali/progenitrici diano la possibilità di un più efficiente trasduzione delle cellule del progenitor di destinazione, nonché taluni modi di genoma editing (regia di omologia riparazione) che richiedono ciclismo cellule si verificano in modo efficiente. Il modello murino serve come un mezzo penetrante e conveniente per affrontare questioni importanti in biologia delle cellule staminali e immunologia prima della sperimentazione in modelli pre-clinici di animali grandi e, come tale, ha servito come il modello primario in cui IUHCT e nell’utero terapia genica sono stati esplorati1,2,3.
Anche se molte variabili svolgono un ruolo importante nel successo di IUHCT e nell’utero gene editing terapia/genomico in modelli murini e grandi animali, una variabile fondamentale è il metodo di consegna del vettore virale o HSCs. La consegna di grandi dosi di donatore HSCs con un effetto di primo passaggio che si verificano nel fegato fetale, l’organo ematopoietico al momento della IUHCT, ha dimostrata di essere determinante nel raggiungimento di livelli macrochimeric di attecchimento in mouse e modelli animali di grandi dimensioni4 ,5. Questo è stato raggiunto tramite un’iniezione di donatore cellule tramite la vena vitellina nel modello del topo e tramite un’iniezione intra-cardiaca nel modello canino. Il percorso di iniezione anche gioca un ruolo fondamentale nell’ottimizzazione del progenitor di diversi organi durante lo sviluppo. Ad esempio, un’iniezione endovenosa tramite la vena vitellina ha dimostrata in modo efficiente trasduce cardiomyocytes ed epatociti segue un fine gestazione iniezione6,7. In alternativa, un’iniezione intra-amniotic dei vettori virali permette il targeting degli organi che sono fisicamente esposti basati su pieghevole/sviluppo embrionale al momento dell’ iniezione8. Questo è meglio esemplificato dal targeting di epitelio respiratorio tramite un’iniezione intra-amniotic nel tardo la gestazione per approfittare dei normali movimenti fetali “respirazione”, che espone le vie respiratorie per il vettore virale nell’amniotico fluido9. Queste due modalità di IUT, per via endovenosa tramite la vena vitellina e intra-amniotic, sono state la base per esperimenti multipli passate e in corso nel nostro laboratorio. In questo protocollo, descriviamo dettagliatamente le modalità di esecuzione per via endovenosa e intra-amniotic IUT nel modello murino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il trapianto in utero è una potenziale terapia per molte patologie congenite che possono essere diagnosticate presto nella gestazione. Il modello murino per IUT permette ai ricercatori di esplorare l’ambiente fetale o di sperimentare con diverse terapie. A seconda di ciò che è stato iniettato e che cosa è presi di mira, per via endovenosa o intra-amniotic nell’utero trapianto può fornire una consegna affidabile di un injectant nello spazio desiderato.
Quando la destinazi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
References
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