. מדווחים שיטות אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע necroptosis כולל מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי לחיות תאים הדמיה, סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים, ואיגוד מבוסס-NMR השומנים.
Necroptosis הוא שביל מוות תאים מתוכנת המופעלות על-ידי הפעלה של קולטן אינטראקציה קינאז 3 (RIPK3), אשר phosphorylates ומפעיל את שושלת היוחסין מעורב קינאז כמו תחום pseudokinase, MLKL, קרע או permeabilize קרום פלזמה . Necroptosis הוא מסלול דלקתיות המשויך פתולוגיות מרובות, כולל מחלת חיסון עצמי, זיהומיות ומחלות לב וכלי דם, שבץ מוחי, הקשורים ניוון מוחיים של סרטן. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים יכול לשמש כדי לאפיין MLKL כמו המוציא של קרום פלזמה קרע necroptosis. עלינו לדמיין את התהליך של necroptosis תאים באמצעות הדמיה לחיות תאים עם מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי פלורסצנטיות, וכן תאים קבוע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, אשר יחד חשף הפצה מחדש של MLKL מ ציטוזול כדי פלזמה ממברנה לפני אינדוקציה של חורים גדולים קרום הפלזמה. אנו מציגים במבחנה תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ניתוח באמצעות ליפידים לזיהוי מאפננים בשם של necroptosis בתיווך MLKL. מבוסס על שיטה זו, אנו מזוהות phosphatidyl-אינוזיטול מלחי (פיפס) ונותנת השומנים מחייב כמותיים קלסרים קריטי של MLKL הנדרשים עבור מיקוד קרום פלזמה ו permeabilization ב necroptosis.
זיהוי רכיבים גנטיים של necroptosis הנחתה את השימוש במודלים לבחון את ההשלכה של necroptosis פיסיולוגיה ומחלות1,2,3,4,5. נוקאאוט של RIPK3 או MLKL בעכברים הייתה מינימלית במשתמע הומאוסטזיס מבוגר ופיתוח רומז ש-necroptosis זו אינה חיונית עבור החיים3,6. יתר על כן, מינים מסוימים אינם מכילים גנים או RIPK3 או MLKL, תומך את תפקיד שאינם חיוניים necroptosis של בעלי חיים7,8. מצד שני, מאתגר חייתיים נוקאאוט עם פתולוגיות שונות המושרה במעבדה חשף תפקיד חשוב של necroptosis דלקת, מולדת חסינות, זיהום נגיפי9,10, 11 , 12.
Necroptosis יכול להיות מופעל במספר דרכים על-ידי איתות באמצעות חיישנים שונים מולדת חסינות, כל אילו התוצאה הפעלת13,1,RIPK314. RIPK3 פעיל phosphorylates בתורו ומפעיל MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. למד ביותר, אולי הדרך המורכבים ביותר, שמוביל הפעלה של RIPK3 כרוך מוות קולטן מצדו, אשר bifurcates מבוסס על הרכב במורד הזרם של מתחמי איתות לזירוז או אפופטוזיס או necroptosis1. Necroptosis מתפתח כאשר איתות באמצעות RIPK1 הוא המועדף ותוצאות האירוסין של RIPK319,20. התוצאה היא חביבה עליהם בקלות על עיכוב תרופתי או מחיקה גנטי של קספאז 8, מעכב אנדוגני בשם של necroptosis שמחזיק necroptosis במפרץ. RIPK1 נקשר ומפעיל RIPK3. דרך נוספת להפעיל את necroptosis היא דרך רצפטורים כמו אגרה TLR3/TLR4 איתות, אשר עוסקת ומפעיל RIPK3 דרך טיר-תחום-המכיל בתדר מתאם אינטרפרון-β (TRIF)21. עוד דרך נוספת למות על ידי necroptosis היא על-ידי הפעלת את חיישן ה-DNA דאי, אשר עוסקת ישירות ומפעיל RIPK322.
MLKL הוא חלבון cytosolic מורכב תחום bundle (NB) החורש N-מסוף, תחום pseudokinase C-מסוף (psKD) מקושרים על ידי אזור רגולטוריות מסולסל3. בתאים נורמליים, MLKL נמצא את ציטוזול שבו הוא חשב להיות קומפלקס לא פעיל עם RIPK314. הפעלה של necroptosis מפעיל זרחון RIPK3 של MLKL בתמונה ההפעלה של psKD, וכן אתרים נוספים שעלולים NB ו הסד3,15,23. זרחון גורם בשינוי הסתגלותי MLKL שתוצאתו דיסוציאציה מ RIPK314. ממעטים להבין שינויים הסתגלותי לשחרר את הסוגר המסולסל מ- psKD24. הסוגר, אשר מכיל את 2 helices, ומתווך oligomerization של MLKL לתוך trimer בשם דרך סליל C-מסוף25. הסליל N-מסוף הסוגר מעכב את התחום NB, אשר חיוני ממברנה permeabilization24,26. בבידוד, תחום NB מספיקה לגרום permeabilization קרום פלזמה ו-24,necroptosis16,27. פעילות פרו-necroptotic של NB הוקמה מחדש העכבר מתחלקים fibroblasts בנכונותם MLKL (mlkl– / – MEFs). NB הוא תחום הכריכה השומנים העוסק מעדיפים את diphosphate phosphatidylinositol 4.5 פוספוליפיד (פיפ2). אנחנו הציע מנגנון stepwise של ההפעלה של MLKL, שבו מסולסל oligomerization מקלה על גיוס של MLKL את קרום פלזמה דרך אינטראקציות החלש של NB עם קבוצה ראש קוטב2 24פיפ. -הקרום, NB עובר מוסדר חשיפה של אתר קשירה גבוהה-זיקה נוספים פיפ2, אשר מוסווה על ידי הסוגר המסולסל ב MLKL לא פעיל. בסך הכל, האינטראקציות מרובים של NB עם פיפ2 יציבות קרום פלזמה המוביל שלה קרע, למרות המנגנון המולקולרי של אירועים אלה לא הובהר.
כאן אנו ממחישים שיטות ספציפיות שימוש כדי לאפיין את הפונקציה של MLKL כמו המוציא להורג של necroptosis24. בפרט, אנו מתמקדים התחום הכי מזערי של MLKL, NB ו הסד (NBB), אשר מווסת על ידי עיכוב הסד והוא יכול להיות מופעל דרך dimerization שנאכפת לזירוז necroptosis ולמסמנים של קרום פלזמה. נתאר מערכת ביטוי inducible שלנו בשילוב עם שנאכפת שיכרון בתיווך FKBP dimerization עבור הדמיה לחיות תאים, ואלקטרון מיקרוסקופי של תאים שעברו necroptosis. בנוסף, אנו ממחישים את הניתוח שלנו במבחנה NMR של האינטראקציות של NBB עם phosphatidylinositols (פיפס).
אנו מספקים פרוטוקולים טכניקות שילבנו ל ערבו MLKL כמו המוציא בשם של קרום פלזמה קרע24. בנוסף לפענח את רשת גנטית המווסת בתיווך MLKL necroptosis, שיטות אלה ניתן באופן עצמאי לאפיון מערכות ביולוגיות מתאימים אחרים. מבחינה מעשית, טכניקות אלה הן כלי גילוי בינונית-נמוכה תפוקה.
באופ…
The authors have nothing to disclose.
. לא-
Cloning and cell line generation | |||
pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
NMR | |||
15N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
Specialized Equipment | |||
IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
Software | |||
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |