Caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en Necroptosis
Summary
Divulgamos los métodos para la caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en necroptosis incluyendo proyección de imagen de la microscopia convencional y confocal de células vivas, análisis de microscopia electrónica y enlace de lípidos basada en NMR.
Abstract
Necroptosis es una vía de muerte celular programada desencadenada por la activación de los receptores interactúan quinasa 3 (RIPK3), que fosforila y activa la pseudokinase quinasa-como dominio de linaje mixto, MLKL, ruptura o permeabilizar la membrana plasmática . Necroptosis es un inflamatorio asociado a múltiples patologías, incluyendo autoinmunidad, enfermedades infecciosas y cardiovasculares, derrame cerebral, neurodegeneración y cáncer. Aquí, describimos protocolos que pueden utilizarse para caracterizar MLKL como el verdugo de la ruptura de la membrana plasmática de la necroptosis. Visualizamos el proceso de la necroptosis en las células usando proyección de imagen de células vivas con microscopía de fluorescencia confocal y convencionales y en células fijas usando microscopia electrónica, que reveló a la redistribución de MLKL desde el citosol al plasma membrana antes de la inducción de grandes agujeros en la membrana plasmática. Presentamos en vitro el análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) con lípidos para identificar supuestos moduladores de la necroptosis MLKL mediada. Basado en este método, identificamos cuantitativas preferencias de unión a lípidos y fosfatidil-inositol fosfatos (PIPs) como crítico aglutinantes de MLKL que se requieren para targeting de membrana plasmática y permeabilización en necroptosis.
Introduction
Identificación de componentes genéticos de la necroptosis ha facilitado el uso de modelos animales para probar la implicación de la necroptosis en fisiología y enfermedad1,2,3,4,5. Nocaut de RIPK3 o MLKL en ratones tenía implicación mínima en desarrollo y adulto homeostasis sugiriendo que necroptosis no es esencial para la vida3,6. Por otra parte, algunas especies no contienen genes RIPK3 o MLKL, apoyando la función de no esenciales de la necroptosis en animales7,8. Por otro lado, desafiando los modelos animales knockout con diversas patologías inducidas en el laboratorio ha revelado un papel importante de la necroptosis en inflamación, la inmunidad innata y la infección viral9,10, 11 , 12.
Necroptosis puede activarse de varias maneras mediante señales a través de sensores de diferentes inmunidad innata, todos los cuales resultan en la activación de RIPK31,13,14. RIPK3 activa a su vez fosforila y activa MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. El más estudiado, y tal vez lo más complejo, conduciendo a la activación de RIPK3 implica la muerte del receptor la ligadura, que bifurca en base a la composición aguas abajo de los complejos de señalización o inducir apoptosis o necroptosis1. Necroptosis sobreviene cuando señalización mediante RIPK1 se favorece y da lugar a compromiso de RIPK319,20. Este resultado es fácilmente favorecido sobre inhibición farmacológica o genética supresión de caspasa 8, un inhibidor endógeno putativo de la necroptosis que mantiene necroptosis en Bahía. RIPK1 ata a y activa RIPK3. Otra manera de activar necroptosis es a través de receptores Toll-like TLR3/TLR4 señalización, que se activa y activa RIPK3 TIR-dominio-que contienen adaptador induce interferón-β (TRIF)21. Sin embargo, otra forma de morir por necroptosis es por activación del sensor de ADN DAI, que directamente se activa y activa RIPK322.
MLKL es una proteína citosólica compuesta por un dominio N-terminal hélice paquete (NB) y un dominio de pseudokinase C-terminal (psKD) Unidos por una abrazadera reguladora región3. En las células normales, MLKL se encuentra en el citosol donde se cree que en un complejo inactivo con RIPK314. Activación de la necroptosis desencadena la fosforilación RIPK3 de MLKL en el circuito de activación de la psKD y potencialmente otros sitios en la NB y soporte3,15,23. La fosforilación induce un cambio conformacional en MLKL que produce disociación de RIPK314. Cambios conformacionales mal entendidos suelte la abrazadera del psKD24. El soporte, que contiene 2 hélices, media Oligomerización de MLKL en un trímero putativo el C-terminal hélice25. La hélice N-terminal de la abrazadera inhibe el dominio NB, que es esencial para la permeabilización de la membrana24,26. En aislamiento, dominio NB es suficiente para inducir la permeabilización de la membrana plasmática y necroptosis16,24,27. La actividad de pro-necroptotic de nota fue reconstituida en fibroblastos embrionarios de ratón deficientes en MLKL (mlkl– / – MEFs). NB es un dominio de unión a lípidos que compromete preferentemente el difosfato de fosfatidilinositol 4,5 de fosfolípidos (PIP2). Hemos propuesto un mecanismo paso a paso de activación de MLKL, donde Oligomerización de apoyo facilita el reclutamiento de MLKL a la membrana plasmática a través de las interacciones débiles de NB con el PIP2 grupo de cabeza polar24. En la membrana, el NB somete a exposición regulada de un sitio de unión de alta afinidad adicional PIP2, el que es enmascarado por la rodillera en MLKL inactivo. En general, las múltiples interacciones de NB con PIP2 desestabilizan la membrana del plasma a su ruptura, aunque no ha aclarado el mecanismo molecular de estos eventos.
Aquí ilustran métodos específicos utilizados para caracterizar la función de MLKL como verdugo de la necroptosis24. En particular, nos centramos en el más mínimo dominio MLKL, NB y ortesis (NBB), que está regulado por la inhibición de la rodillera y pueden activarse a través de la dimerización forzada para inducir necroptosis y ruptura de la membrana plasmática. Describimos nuestro sistema de expresión inducible con forzada dimerización de FKBP-mediada inducida por medicamentos para la proyección de imagen de células vivas y la microscopia electrónica de las células que experimentan necroptosis. Además, ilustramos nuestro análisis en vitro NMR de las interacciones de NBB con fosfatidilinositoles (PIPs).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ofrecemos protocolos para técnicas que se combinaron implicado MLKL como el supuesto verdugo de ruptura de membrana plasmática24. Además de descifrar la red reguladora que regula MLKL-mediada de la necroptosis, estas técnicas se pueden utilizar independientemente para caracterizar otros sistemas biológicos adecuados. Prácticamente hablando, estas técnicas son herramientas de descubrimiento de medio a bajo rendimiento.
Habitualmente hemos utilizado proyección de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
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