Behandelende zoogdieren Axon regeneratie: In Vivo Electroporation van volwassen muis achterwortelganglia Ganglion
Summary
Electroporation is een effectieve aanpak te leveren van genen van belangen in cellen. Door deze aanpak in vivo toe te passen op de neuronen van volwassen muis achterwortelganglia ganglion (DRG), beschrijven we een model voor het bestuderen van axon regeneratie in vivo.
Abstract
Electroporation is een essentiële, niet-virale gen transfectie benadering te introduceren van DNA-plasmiden of kleine molecules van RNA in cellen. Een sensorisch neuron in de achterwortelganglia ganglion (DRG) strekt zich uit van een enkele axon met twee takken. Eén tak gaat naar de perifere zenuwen (perifere tak), en de andere tak voert het ruggenmerg via de achterwortelganglia (centrale tak). Na de neurale letsel regenereert de perifere tak krachtig overwegende dat de centrale tak doet niet regenereren. Als gevolg van de hoge regeneratief vermogen, zintuiglijke axon regeneratie wijd gebruikt als een modelsysteem te onderzoeken zoogdieren axon regeneratie in zowel het perifere zenuwstelsel (PNS) en het centrale zenuwstelsel (CNS). Hier beschrijven we een protocol van tevoren vastgelegde benadering om te manipuleren genexpressie in volwassen sensorische neuronen in vivo via electroporation. Op basis van transfectie met plasmiden of kleine oligos van RNA (siRNAs of microRNAs), de aanpak maakt het mogelijk voor beide experimenten van de verlies – en winst-van-functie te bestuderen van de rol van genen-van-belangen of microRNAs in verordening van axon regeneratie in vivo. Bovendien, de manipulatie van gen expressie in vivo controleerbaar zowel stoffelijk als ruimtelijk binnen een relatief korte tijd cursus. Dit modelsysteem biedt een uniek instrument voor het onderzoek naar de moleculaire mechanismen waarmee zoogdieren axon regeneratie gereglementeerde in vivo is.
Introduction
Verwondingen in het zenuwstelsel veroorzaakt door neurale trauma of verschillende neurodegeneratieve ziekten meestal resulteren in defecten in motorische, zintuiglijke en cognitieve functies. Onlangs, heeft veel moeite besteed aan herstel van het regeneratieve potentie in volwassen neuronen te herstellen van de fysiologische functionsof gewond neuronen1,2,3. Sensorische neuronen in de DRG zijn een cluster van zenuwcellen die verschillende zintuiglijke prikkels, zoals pijn, temperatuur, touch of lichaamshouding, naar de hersenen doorgeven. Elk van deze neuronen is pseudo-unipolaire en bevat een enkele axon die bifurcates met één tak uitbreiding naar de periferie en de andere tak die richting het ruggenmerg4. De volwassen sensorische neuronen in DRG behoren tot een paar volwassen zoogdieren neuronen bekend om te regenereren hun axonen actief na blessure. Vandaar, beschadigingen van sensorische axonen zijn uitgebreid tewerkgesteld als een cruciale model te bestuderen van de mechanismen van axonale regeneratie in vivo.
In vivo gene transfectie technieken, die meestal minder tijdrovende instellen en flexibeler dan het gebruik van transgene dieren, speel essentiële rol in het bestuderen van de functies van genen en signalering van trajecten in het zenuwstelsel. De belangrijkste technieken kunnen worden onderverdeeld in twee benaderingen: instrument- en virus gebaseerde5. Viral gebaseerde in vivo gene levering in volwassen neuronen kan bieden nauwkeurige Spatio manipulatie van gen expressie6. Arbeidsintensieve processen zijn echter betrokken bij virale gebaseerde methoden, zoals de productie en zuivering van virale deeltjes die met het gewenste gen. Daarnaast kunnen veel virale vectoren activeren het immuunsysteem van de gastheer, die kan interfereren met de data-acquisitie, data-analyse en de interpretatie van de experimentele resultaten mogelijk te misleiden. Electroporation, een typisch instrument gebaseerde transfectie aanpak, gebruikt een elektroimpuls te vergroten van de permeabiliteit van de cel en nucleaire membranen Transient, die gunsten van de toestroom van gene vectoren of kleine RNA oligos vanuit de ruimte buiten de cellen7 . In vitro electroporation wordt algemeen erkend als een voorbijgaande maar zeer efficiënte strategie voor het manipuleren van gerichte genexpressie in veel celtypen. Hoewel in vivo electroporation alleen tot voorbijgaande genexpressie met lage transfecting efficiëntie ten opzichte van virale vectoren leidt, heeft diverse voordelen ten opzichte van virale benaderingen. Bijvoorbeeld, kan het worden toegepast op vrijwel alle weefsels en cellen7,8,–9. Bovendien ofwel plasmiden genen-of-interest of kleine RNA oligos (b.v., siRNAs, microRNAs) tegen bepaalde afschriften codering kunnen worden geïnjecteerd rechtstreeks in het doelweefsel en dan elektrisch gepulseerde, waardoor de procedure minder arbeid – en tijd – consumeren. Bovendien is het mogelijk meerdere plasmiden en RNA oligos gelijktijdig met één electroporation transfecting.
We hebben vastgesteld van een in vivo electroporation aanpak om te manipuleren genexpressie in volwassen muis sensorische neuronen en met succes toegepast en gevalideerd dergelijke aanpak in talrijke pionier studies1,,2,3 ,8,10. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol ter vergemakkelijking van het gebruik van deze benadering voor toekomstige studies van zoogdieren axon regeneratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende chirurgische stappen moet bijzondere aandacht. De L4 en L5 DRG (locatie van SOMA), die de nervus ischiadicus domineren, moeten correct worden geïdentificeerd en ingespoten met gene constructies. Anders, het GFP-labeling afwezig zal zijn in de Ischiaszenuw axonen. De iliacale toppen kunnen worden beschouwd als nuttig anatomische monumenten te lokaliseren L4 en L5 DRG. In de meeste muizen is het gemeenschappelijke tussen L5 en L6 wervels facet naaste iliac toppen12. Als alternatief, L…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studie werd gefinancierd (toegekend aan F-Q. Z.) door NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), de Craig H. Neilsen Foundation en de Stichting BrightFocus.
Materials
| ECM 830 Square wave electroporation system | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | For in vivo electroporation |
| Tweezertrodes electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0524 | For in vivo electroporation, 1 mm flat |
| Picospritzer III | Parker Instrumentation | 1096 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Glass Capillary Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1902328 | |
| Stereo Dissection Microscope | Leica | M80 | |
| Microsurgery Rongeur | F.S.T | 16221-14 | |
| Microsurgery Forceps | FST by DUMONT, Switzerland | 11255-20 | Only for sciatic nerve crush |
| Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | 10 cm, standard wall |
| Tape | Fisherbrand | 15-901-30 | For fixing the mouse on the corkboard |
| 2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin stock solution |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Avertin stock solution |
| siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC003 | Non-target siRNA with fluorescence |
| microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 | Dharmacon | CP-004500-01-05 | Non-target microRNA with fluorescence |
| Plasmids preparation kit | Invitrogen Purelink | K210016 | GFP-coding plasmid preparation |
| Fast Green Dye | Millipore-Sigma | F7252 | For better visualization of the DRG outline during injection |
| Ketamine | Putney, Inc | NDC 26637-731-51 | Anesthesia induction |
| Xylazine | AnaSed | NDC 59399-110-20 | Anesthesia induction |
| Acetaminophen | McNeil Consumer Healthcare | NDC 50580-449-36 | Post-surgical pain relief |
References
- Saijilafu, , et al. PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1. Nature Communications. 4, 2690 (2013).
- Zhang, B. Y., et al. Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).
- Jiang, J. J., et al. MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression. Cell Death & Disease. 6, 1865 (2015).
- Krames, E. S. The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain. Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).
- Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).
- Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions. Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).
- Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Liu, C. M., et al. MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration. Genes & Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologie du développement. 240 (1), 237-246 (2001).
- Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nature Communications. 2, 543 (2011).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859 (2016).
- Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique. Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).
- Dommisse, G. F. The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).
- Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice. Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).
