Electroporation 셀에 관심사의 유전자를 전달 하는 효과적인 접근 이다. 적용 하 여이 접근에서 vivo에서 성인 마우스 지 루트 신경 절 (DRG)의 신경에, 축 삭 재생 비보를 공부 하는 모델을 설명 합니다.
Electroporation 세포로 DNA 플라스 미드 또는 작은 RNA 분자를 소개 하는 필수적인 비 바이러스 성 유전자 transfection 접근 이다. 지 루트 신경 절 (Drg)에 감각 신경 두와 단일 축 삭을 확장합니다. 1 개 분 지가 주변 신경 (주변 지점), 그리고 다른 지점 입력 지 루트 (중앙 지점)를 통해 척수. 신경 손상 후 주변 지점 중앙 지점에 다시 생성 하지 않습니다 반면 견고 하 게 재생성 합니다. 높은 재생 능력으로 인해 감각 축 삭 재생 널리 사용 되었습니다 모델 시스템으로 서 말 초 신 경계 (PNS)에 중앙 신경 조직 (CNS) 포유류 축 삭 재생을 공부. 여기, 우리는 성숙한 감각 뉴런에서 vivo에서 electroporation 통해 유전자 발현 조작 하 이전 설립된 접근 프로토콜을 설명 합니다. Transfection 플라스 미드 또는 작은 RNA oligos (siRNAs 또는 microRNAs)을 바탕으로, 접근 방식 모두 손실 및 이득-의-기능 실험 연구 관심사의 유전자 또는 축 삭 재생 비보의 규제 microRNAs의 역할을 수 있습니다. 또한, 유전자 표현에 vivo에서 의 조작 제어할 수 있습니다 공간 및 일시적으로 비교적 짧은 시간 과정 내에서. 이 모델 시스템은 포유류 축 삭 재생 규제 vivo에분자 메커니즘을 조사 하는 독특한 도구를 제공 합니다.
신경 외상으로 인 한 신 경계에서 부상 또는 다양 한 신경 퇴행 성 질환은 보통 모터, 감각 및 인지 기능에 결함에 결과. 최근, 많은 노력 복원 생리 functionsof 부상 신경1,2,3성인 신경 재생 효능 다시 설립에 헌신 하고있다. DRG에 감각 신경은 통증, 온도, 터치, 또는 몸 자세, 뇌 등 다른 감각 자극을 전달 하는 신경 세포의 클러스터. 이러한 뉴런의 각각 의사 유 니 폴라 이며 주변으로 확장 한 분기와 척수4향하고 다른 분기를 분기 하는 단일 축 삭을 포함 합니다. Drg의 성인 감각 신경 세포는 부상 후 적극적으로 그들의 축 삭을 재생성 하기 위해 알려진 몇 가지 성숙한 포유류 뉴런 중입니다. 따라서, 감각 축 삭의 상해는 광범위 하 게 고용 되었다 중요 한 모델로 axonal 재생 비보의 메커니즘을 연구.
Vivo에서 유전자 transfection 기법, 일반적으로 덜 설정 시간과 유전자 변형 동물을 사용 하 여 보다는 유전자의 기능을 공부 하 고 신 경계에 경로 신호에 필수적인 역할을 연주 하고있다. 주요 기술 두 가지 방법으로 분류 될 수 있다: 악기 및 바이러스 기반5. 성인 신경 세포에 유전자 배달 vivo에서 바이러스 성 기반 유전자 식6의 정확한 spatiotemporal 조작을 제공할 수 있습니다. 그러나, 노동 집약적인 프로세스는 바이러스-기반 방법, 생산 등 원하는 유전자를 포함 하는 바이러스 성 입자의 정화에서에서 포함 된다. 또한, 많은 바이러스 성 벡터 데이터 수집, 데이터 분석을 방해 하 고 실험 결과의 해석 가능성이 오해 수 있습니다 호스트의 면역 시스템을 활성화 수 있습니다. Electroporation, 일반적인 악기에 기초를 둔 transfection 접근 유전자 벡터 또는 세포7 외부 공간에서 작은 RNA oligos의 호의 정도, 세포와 핵 막의 침투성을 증가 하는 전기 펄스를 사용 하 여 . 생체 외에서 electroporation 널리 많은 세포 유형에 타겟된 유전자 발현을 조작 하기 위한 과도 하지만 매우 효율적인 전략으로 인식 된다. Vivo에서 electroporation만 일시적인 유전자 발현 바이러스 성 벡터에 비해 낮은 transfecting 효율 리드, 바이러스 접근 다양 한 장점이 있다. 예를 들어, 그것은 거의 모든 조직 및 세포7,,89에 적용할 수 있습니다. 또한, 특정 성적 증명서에 대 한 관심사의 유전자 또는 작은 RNA oligos (예: siRNAs, microRNAs) 인코딩 중 플라스 미드 대상 조직에 직접 주입 하 고 수 다음 전기적 펄스, 절차 하 게 하는 더 적은 노동-고 시간-소모입니다. 또한, 여러 개의 플라스 미드 및 단일 electroporation와 동시에 RNA oligos transfecting 가능 하다.
우리 성인 마우스 감각 신경 세포에 유전자 발현 조작 하 비보에 electroporation 접근 설립 및 성공적으로 적용 하 고 수많은 개척자 연구1,2,3 같은 접근 검증 ,8,10. 여기, 우리 포유류 축 삭 재생의 미래 연구를 위한이 방법의 사용을 촉진 하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시.
여러 수술 단계 특히 주의 필요합니다. L4 그리고 L5 Drg (somas의 위치), 좌 골 신경 지배, 올바르게 식별 하 고 유전자 구조와 주입을 해야 합니다. 그렇지 않으면, GFP 레이블링 됩니다 결 석 좌 골 신경 축 삭에. 장 골 볏 L4 및 L5 Drg를 정확 하 게 유용한 해부학 적 랜드마크로 서 볼 수 있습니다. 대부분의 마우스에 L5, L6 척추 사이 관절 면은 장 골 볏12인접. 또는, L3 DRG 선택할 수 있습?…
The authors have nothing to disclose.
연구 추진 하는 사업 (F Q를 수 여. Z.) NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), 크레이그 H. Neilsen 재단 및 BrightFocus 재단.
ECM 830 Square wave electroporation system | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | For in vivo electroporation |
Tweezertrodes electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0524 | For in vivo electroporation, 1 mm flat |
Picospritzer III | Parker Instrumentation | 1096 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
Glass Capillary Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1902328 | |
Stereo Dissection Microscope | Leica | M80 | |
Microsurgery Rongeur | F.S.T | 16221-14 | |
Microsurgery Forceps | FST by DUMONT, Switzerland | 11255-20 | Only for sciatic nerve crush |
Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | 10 cm, standard wall |
Tape | Fisherbrand | 15-901-30 | For fixing the mouse on the corkboard |
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin stock solution |
2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Avertin stock solution |
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC003 | Non-target siRNA with fluorescence |
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 | Dharmacon | CP-004500-01-05 | Non-target microRNA with fluorescence |
Plasmids preparation kit | Invitrogen Purelink | K210016 | GFP-coding plasmid preparation |
Fast Green Dye | Millipore-Sigma | F7252 | For better visualization of the DRG outline during injection |
Ketamine | Putney, Inc | NDC 26637-731-51 | Anesthesia induction |
Xylazine | AnaSed | NDC 59399-110-20 | Anesthesia induction |
Acetaminophen | McNeil Consumer Healthcare | NDC 50580-449-36 | Post-surgical pain relief |