Undersøker pattedyr Axon gjenfødelse: I Vivo Electroporation av voksen mus Dorsal Root Ganglion

Summary

Electroporation er en effektiv tilnærming til å levere gener interesser i celler. Ved å bruke denne tilnærmingen i vivo på nervecellene i voksen mus dorsal root ganglion (DRG), beskriver vi en modell for å studere axon gjenfødelse i vivo.

Abstract

Electroporation er en viktig ikke-viral genet transfection å innføre DNA plasmider eller små RNA molekyler i celler. En sensorisk Nevron i dorsal root ganglion (DRGs) utvider et enkelt axon med to grener. En gren går til tilleggsutstyret nerve (eksterne gren), og den andre grenen inn ryggmargen gjennom dorsal root (sentrale gren). Etter nevrale skaden regenererer perifere grenen robust mens den sentrale grenen ikke regenereres. På grunn av den høye regenerative kapasiteten, har sensoriske axon gjenfødelse vært mye brukt som en modell for å studere pattedyr axon gjenfødelse både perifere nervesystemet (PNS) og sentralnervesystemet (CNS). Her beskriver vi en tidligere etablerte tilnærming protokoll for å manipulere genuttrykk i eldre sensoriske neurons i vivo via electroporation. Basert på hva med plasmider eller liten RNA-oligos (siRNAs eller microRNAs), gir tilnærmingen både tap og gevinst-av-funksjon eksperimenter for å studere roller av gener av interesser eller microRNAs i regulering av axon gjenfødelse i vivo. I tillegg kan manipulering av genet uttrykk i vivo kontrolleres både romlig og timelig i en relativt kort tid kurs. Denne modellen systemet gir et unikt verktøy for å undersøke molekylære mekanismer som pattedyr axon regenereringen er regulert i vivo.

Introduction

Skader i nervesystemet forårsaket av nevrale traumer eller forskjellige nevrodegenerative sykdommer som regel resultere i feil i motoren, sensoriske og kognitive funksjoner. Nylig har mye innsats vært viet til regenerativ styrke re-etablering i voksen neurons å gjenopprette den fysiologiske functionsof skadet neurons^1,2,3. Sensoriske neurons i DRG er en klynge av nerveceller som formidler ulike sensoriske stimuli, som smerte, temperatur, trykk eller kroppsstilling, til hjernen. Hver av disse neurons pseudo Unipolare og inneholder et enkelt axon som bifurcates med en gren mot periferien og den andre grenen vei mot ryggmargen⁴. Voksen sensoriske neurons i DRGs er blant noen eldre pattedyr neurons kjent å regenerere deres axons aktivt etter skader. Derfor har skader av sensoriske axons vært mye ansatt som avgjørende modell å studere mekanismer for axonal gjenfødelse i vivo.

I vivo genet transfection teknikker, som er vanligvis mindre tidkrevende å definere og mer fleksibelt enn bruke transgene dyr, har spilt viktige roller i å studere funksjonene av gener og signalnettverk trasé i nervesystemet. De viktigste teknikkene kan kategoriseres i to tilnærminger: instrument- og virus-baserte⁵. Viral-basert i vivo gen levering i voksen neurons kan gi nøyaktig spatiotemporal manipulasjon av gene expression⁶. Imidlertid er arbeidskrevende prosesser involvert i viral-baserte metoder, for eksempel produksjon og rensing av virus partikler som inneholder ønsket genet. I tillegg kunne mange viral vektorer aktivere immunsystemet til verten, som kan forstyrre datainnsamling, analyse og muligens villede tolkning av eksperimentelle resultater. Electroporation, en typisk instrument-baserte transfection tilnærming, bruker en elektrisk puls for å øke permeabilitet av cellen og kjernefysiske membraner transiently, noe som favoriserer tilstrømningen av genet vektorer eller liten RNA oligos fra plassen utenfor cellene⁷ . In vitro electroporation er anerkjent som en midlertidig, men svært effektive strategi for å manipulere målrettet genuttrykk i mange celletyper. Selv om i vivo electroporation fører bare til midlertidig genuttrykk med lav transfecting effektivitet sammenlignet med viral vektorer, har ulike fordeler over viral tilnærminger. Det kan for eksempel brukes til nesten alle^7,8,9-med vev og celler. I tillegg enten plasmider koding gener steder eller liten RNA oligos (f.eks siRNAs, microRNAs) mot visse utskrifter kan injiseres vevet direkte og deretter elektrisk pulserende, som gjør prosedyren mindre arbeids – og tid – forbruker. Videre er det mulig å transfecting flere plasmider og RNA oligos samtidig med enkel electroporation.

Vi har etablert en i vivo electroporation tilnærming for å manipulere genuttrykk i voksen mus sensoriske neurons og brukt og validert slik tilnærming i mange pioneer studier^{1,2,3 ,8,10}. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å lette bruken av denne tilnærmingen for fremtidige studier av pattedyr axon gjenfødelse.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med dyr protokollen godkjent av Johns Hopkins institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. 1. materialer og reagenser Dyr Bruk seks-uke-gamle kvinnelige CF1 mus veier 30-35 g for eksperimenter.Merk: Mus var gruppen plassert (5 mus per bur) i individuelt ventilert sterilisert bur med 1/4″ korn cob senger og 2″ firkant nestlets for nesting. Merdene ble opprettholdt i en kontrollert 12-h lys og mørke syklus og romt…

Representative Results

Å kvantifisere cytotoksisitet gjeldende protokollen og til å validere at transfection i vivo DRG electroporation er høy nok, vi injisert og electroporated fluorescently-merket microRNA eller siRNA i L4 og L5 DRGs. De frittliggende DRGs ble behandlet gjennom cryo-skjæring og immunohistochemistry (figur 1A-B). Ved beregning celle overlevelse etter injeksjon og electroporation, var de intakt DRGs fra L4 og L5 høstet og behandlet gj…

Discussion

Flere kirurgisk trinnene krever spesiell oppmerksomhet. L4 og L5 DRGs (plassering av somas), som dominerer sciatic nerve, må være korrekt identifisert og injisert med gene konstruksjoner. Ellers GFP-merkingen vil være fraværende i sciatic nerve axons. Iliaca toppene kan vises som nyttig anatomiske landemerker å finne L4 og L5 DRGs. I de fleste mus er fasett felles mellom L5 og L6 vertebrae proximate til iliaca toppene¹². Alternativt kan L3 DRG velges i stedet for L5, spesielt for analyser som…

Materials

ECM 830 Square wave electroporation system	BTX Harvard Apparatus	45-0052	For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0524	For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller	NARISHIGE	PC-10
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	1902328
Stereo Dissection Microscope	Leica	M80
Microsurgery Rongeur	F.S.T	16221-14
Microsurgery Forceps	FST by DUMONT, Switzerland	11255-20	Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, standard wall
Tape	Fisherbrand	15-901-30	For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit	Invitrogen Purelink	K210016	GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Anesthesia induction
Xylazine	AnaSed	NDC 59399-110-20	Anesthesia induction
Acetaminophen	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Post-surgical pain relief