التحديد الكمي لنشاط نقص التصبغ في المختبر
Summary
يصف لنا ثلاثة أساليب تجريبية لتقييم النشاط نقص التصبغ للمواد الكيميائية في المختبر: القياس الكمي لمحتوى النشاط أو 2) الميلانين التيروزينات 1) الخلوية و 3) قياس الميلانين بتحليل صورة وتلطيخ الميلانين الخلوية.
Abstract
تقدم هذه الدراسة الطرق المختبرية للتحديد الكمي لنقص التصبغ النشاط في المختبر. هو توليف الميلانين، صبغة رئيسية في الخلايا الصباغية، استجابة للعوامل الخلوية وبيئية متعددة. الميلانين يحمي خلايا الجلد من أضرار الأشعة فوق البنفسجية، ولكن أيضا بالوظائف البيولوجية الفيزيائية والكيميائية الحيوية. الإنتاج المفرط أو تراكم الميلانين في الخلايا الصباغية يمكن أن يسبب مشاكل جلدية، مثل البقع الداكنة والكلف، النمش والشامات. ولذلك، من المهم مراقبة ميلانوجينيسيس مع عوامل نقص التصبغ في الأفراد ذوي الاحتياجات السريرية أو مستحضرات التجميل. أساسا هو توليف الميلانين في الأجسام الصباغية الخلايا الصباغية في عملية بيوكيميائية معقدة تسمى ميلانوجينيسيس، الذي يتأثر بالخارجية والعوامل الجوهرية، مثل الهرمونات، والتهاب، والعمر، والتعرض للضوء فوق البنفسجي. يصف لنا ثلاثة أساليب لتحديد النشاط نقص التصبغ من المواد الكيميائية أو المواد الطبيعية في الخلايا الصباغية: قياس النشاط التيروزينات 1) الخلوية ومحتوى 2) الميلانين، والميلانين الخلوية 3) المصبوغة وتحديد مع الصورة تحليل.
في ميلانوجينيسيس، يحفز التيروزينات هذه الخطوة الحد من معدل تحويل لتيروزين في 3 و 4-ديهيدروكسيفينيلالانيني (L-DOPA)، ومن ثم إلى دوباكوينوني. ولذلك، تثبيط التيروزينات إليه نقص التصبغ الأولية. في الصباغية مثقف، يمكن قياسها كمياً التيروزينات النشاط عن طريق إضافة لدوبا كركيزة وقياس الإنتاج دوباكوينوني التي كانت. ويمكن أيضا قياس ميلانوجينيسيس بالتحديد الكمي لمحتوى الميلانين. يتم استخراج الكسر الخلوية التي تحتوي على الميلانين مع هيدروكسيد الصوديوم وهو كمية الميلانين سبيكتروفوتوميتريكالي. وأخيراً، يمكن قياسها كمياً محتوى الميلانين بتحليل الصور بعد ماسون فونتانا صبغة الميلانين. على الرغم من أن نتائج هذه الاختبارات في المختبر قد لا دائماً تكون مستنسخة في جلد الإنسان، تستخدم هذه الأساليب على نطاق واسع في البحوث ميلانوجينيسيس، خاصة كخطوة أولى لتحديد احتمال نقص التصبغ النشاط. يمكن أيضا استخدام هذه الأساليب لتقييم الخلايا الصباغية، والنمو، والتمايز. ضمان نتائج متسقة مع ثلاثة أساليب مختلفة صحة الآثار.
Introduction
الميلانين يلعب دوراً حاسما في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض، وعلم السموم للعديد من الأجهزة بما في ذلك الجلد والعيون، والدماغ1. المهام الرئيسية الميلانين تأثيرات الصور-الفحص والبيوكيميائية. يمتص الميلانين الخفيفة القريبة من الأشعة تحت الحمراء والمرئية فضلا عن إشعاع الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)، مع معدلات زيادة امتصاص عند أطوال موجية أقصر من الضوء؛ وهكذا، الميلانين تحمي الأنسجة من الأضرار التي يسببها الضوء المرئي أو الأشعة فوق البنفسجية الإشعاع2. الميلانين هو مضاد للأكسدة وقد تقارب للمعادن وغيرها من المواد الكيميائية السامة؛ ولذلك، يمكن أن تحمي الأنسجة من الإجهاد التأكسدي والكيميائية3. بيد الإفراط في إنتاج الميلانين يسبب مشاكل الأمراض الجلدية.
كمية ونوعية الميلانين في الجلد وقزحية العين هي أهم العوامل المحددة للون قزحية العين والجلد. قد يكون الأفراد تفضيلات لون البشرة المختلفة؛ لصالح بعض الجلد المدبوغة، بينما آخرون يفضلون ألوان البشرة أخف. اعتماداً على هذه التشكيلات الجانبية للمستهلك، استحدثت مستحضرات التجميل نقص التصبغ لإرضاء الأسواق الفردية للجلد يفضل الألوان4. وبناء على ذلك، دراسات النشاط نقص التصبغ ومكافحة ميلانوجينيك أهميتها علمياً وعملياً على حد سواء.
ميلانوجينيسيس هو عملية معقدة تخليق الميلانين الحيوي من خلال سلسلة من التفاعلات الكيميائية الانزيمية وعفوية في الخلايا الصباغية. الصباغية واحد محاط بحوالي 36 الكيراتينيه والصباغية الميلانين التوليف المصانع التي تقوم بتوزيع منتجاتها إلى الكيراتينيه المجاورة. في الجلد، ويتم نقل الميلانين تنتج وتخزن في حجرة ميلانوسومال الخلايا الصباغية إلى الكيراتينيه المجاورة في البشرة عبر dendrites.
لام-التيروزين بمثابة الركيزة الأولى ميلانوجينيسيس والتيروزينات إنزيم يحفز اثنين من ردود فعل متتالية تحويل لتيروزين في 3 و 4-ديهيدروكسيفينيلالانيني (دوبا) ومن ثم إلى دوباكوينوني. ردود الفعل هذه هي الخطوة الحد من معدل في ميلانوجينيسيس5،6. وبناء على ذلك، يمكن قياس النشاط نقص التصبغ أولاً بتقييم النشاط التيروزينات الخلوية مباشرة. للقيام بذلك، يتم المحتضنة مقتطفات الصباغية التي تحتوي على التيروزينات مع دوبا ويمكن قياس دوباكوينوني المنتجة في العينات التي كانت في 475 نيوتن متر. القيم التي يتم تطبيع بتركيزات بروتين العينات، والمواد مع نقص التصبغ نتيجة النشاط في تشكيل دوباكوينوني أقل مقارنة مع عناصر التحكم.
ثانيا، يمكن قياس النشاط نقص التصبغ بقياس الميلانين في الخلايا الصباغية مثقف مباشرة. بعد علاج الخلايا بمادة الاختبار، يتم استخراج الميلانين تحت ظروف قلوية ومحتوى الميلانين هو الكمية التي كانت في 400 نانومتر. سيؤدي إلى انخفاض محتوى الميلانين من ضوابط7عامل نقص التصبغ.
وأخيراً، يمكن قياسها كمياً النشاط نقص التصبغ بصبغة الميلانين فونتانا-ماسون وتحليل الصور اللاحقة. في تلطيخ فونتانا-ماسون، حبيبات الميلانين خفض نترات الأمونيا والفضة لدولة معدني أسود مرئية والمناطق السوداء من الخلايا الموجودة في الصور المجهرية تمثل كمية الميلانين.
عادة ما يعطي عامل نقص التصبغ نتائج متسقة وقابلة للمقارنة مع هذه الأساليب الثلاثة، مما يؤكد أن نشاط المضمون صالحة. وبدلاً من ذلك، قد يكون من المفيد لقياس التعبير عن الجينات الرئيسية والبروتينات في ميلانوجينيسيس استجابة لمادة اختبار لدراسة النشاط نقص التصبغ. البروتينات ذات الصلة التيروزينات (الحزب-1) ودوباتشرومي توتوميراسي (الحزب-2) بالإضافة إلى التيروزينات، الإنزيمات الحيوية في ميلانوجينيسيس8. عامل النسخ مرتبطة بتشوهات عامل النسخ (ميتف) منظم رئيسي في ميلانوجينيسيس والتحديد الكمي لمستويات التعبير الجيني/البروتين أو تحليل نشاط مروج يمكن استخدامها أيضا لتقييم النشاط نقص التصبغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد عرضنا بروتوكولات لتقييم النشاط نقص التصبغ لاختبار المركبات باستخدام الخلايا الصباغية مثقف. وأظهرت نتائج الممثل أثر نقص التصبغ اربوتين، مثبط التيروزينات تثبيط التيروزينات النشاط والخلوية محتوى الميلانين. هذه الأساليب تستخدم على نطاق واسع في ميلانوجينيك مكافحة نشاط البحث. باستخدام ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها معهد كوريا لتخطيط وتقييم التكنولوجيا في مجال الأغذية والزراعة، والحراجة (إيبيت) من خلال “برنامج تطوير التكنولوجيا” الزراعية-الصناعة البيولوجية، تموله وزارة الزراعة والأغذية، والشؤون الريفية (مافرا ) (116159-02-2-WT011) ومدرسة علوم الحياة والتكنولوجيا الحيوية ل BK21 بالإضافة إلى ذلك، جامعة كوريا.
Materials
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
References
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Galvan, I., Solano, F. Melanin chemistry and the ecology of stress. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).
- Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
- Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
- Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
- Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents – existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
- Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
- Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
- Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
- Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
- Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
- D’Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. Signaling pathways in melanogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
- Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
- Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
- Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).
