생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화
Summary
체 외 화학 물질의 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위한 세 가지 실험 방법 설명: 1) 셀룰러 tyrosinase 활동과 2) 멜 라 닌 콘텐츠, 및 3) 멜 라 닌 세포의 멜 라 닌 얼룩 및 이미지 분석에 의해 측정의 정량화.
Abstract
이 연구는 생체 외에서 hypopigmentation 활동의 정량화에 대 한 실험실 방법을 선물 한다. Melanocytes에 주요 안료 멜 라 닌은 여러 세포와 환경 요인에 대 한 응답에서 합성 됩니다. 멜 라 닌 자외선 손상 으로부터 피부 세포를 보호 하지만, 또한 생물 및 생 화 확 적인 기능을가지고. 과도 한 생산 또는 축적 melanocytes에 멜 라 닌의 주 근 깨, 검 버섯, melasma, 사마귀 등 피부 문제를 일으킬 수 있습니다. 따라서, hypopigmentation 에이전트 melanogenesis 제어 임상 또는 화장품 요구와 개인에서 중요 하다. 멜 라 닌은 주로 외부 영향 melanogenesis 라는 복잡 한 생 화 확 적인 과정에 내재 성 요인, 호르몬, 염증, 나이, 등 자외선 빛 노출 melanocytes melanosomes에 합성 됩니다. 우리는 화학 물질 또는 melanocytes에 자연 물질의 hypopigmentation 활동을 결정 하는 세 가지 방법을 설명: 1) 셀룰러 tyrosinase 활동 및 2) 멜 라 닌 콘텐츠 및 이미지 3) 얼룩과 측량 셀룰러 멜 라 닌의 측정 분석입니다.
Melanogenesis에서 tyrosinase L-티로신 그리고 dopaquinone로 3, 4-dihydroxyphenylalanine (l 아미노산의 일종)으로 변환 하는 속도 제한 단계 catalyzes. 따라서 tyrosinase의 저해는 기본 hypopigmentation 메커니즘입니다. 교양된 melanocytes에 tyrosinase 활동 기판으로 아미노산의 일종을 추가 하 고 dopaquinone 생산 분 광 광도 법으로 측정 하 여 측정할 수 있습니다. Melanogenesis 또한 멜 라 닌 콘텐츠를 측정 하 여 측정할 수 있습니다. 포함 하는 멜 라 닌 세포 일부는 NaOH와 함께 추출 되 고 멜 라 닌 spectrophotometrically 계량. 마지막으로, 멜 라 닌 콘텐츠 폰 타나-마 송 멜 라 닌의 얼룩이 다음 이미지 분석에 의해 측정할 수 있습니다. 이러한 생체 외 분석 실험의 결과 항상 복제 될 수 없다 인간의 피부에, 비록 이러한 메서드는 널리 특히 잠재적인 hypopigmentation 활동을 식별 하는 초기 단계로 melanogenesis 연구에 사용. 이 방법 또한 melanocyte 활동, 성장과 분화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 세 가지 다른 방법으로 일관 된 결과 효과의 유효성을 확인합니다.
Introduction
멜 라 닌은 생리학, 병리학, 피부, 눈, 뇌1등 여러 장기의 독성에 중요 한 역할을 한다. 멜 라 닌의 주요 기능 사진 심사 및 생 화 확 적인 효과가 있습니다. 멜 라 닌 근처-적외선과 보이는 빛으로 자외선 (UV) 방사선, 짧은 파장의 빛;에서 증가 흡수 속도와 흡수 따라서, 멜 라 닌 가시광선 이나 자외선 방사선2로 인 한 손상 으로부터 조직을 보호 합니다. 멜 라 닌은 항 산화 및 금속과 다른 독성 화학 물질;에 대 한 선호도 따라서, 그것은 산화 화학 스트레스3에서 조직을 보호할 수 있습니다. 그러나, 멜 라 닌의 과도 한 생산 피부 문제를 발생합니다.
피부와 홍 채에 있는 melanin의 품질과 수량은 아이리스와 피부 색깔의 가장 중요 한 결정 요인. 개인은 다른 피부 색깔 기본 설정; 있을 수 있습니다. 다른 더 가벼운 피부 색깔을 선호 하는 동안 일부 검게 그을린된 피부를 선호 합니다. 이러한 소비자 프로 파일에 따라 hypopigmentation 화장품 선호 피부 색상4에 대 한 개별 시장을 만족 시키기 위해 개발 되었습니다. 따라서, hypopigmentation 및 안티 melanogenic 활동의 연구 모두 과학적으로 그리고 실제적으로 중요 하다.
Melanogenesis는 멜 라 닌 생 합성 효소 및 자발적인 화학 반응을 melanocytes에 일련의 복잡 한 프로세스입니다. 한 melanocyte 약 36 keratinocytes 둘러싸여 있으며 melanocytes 이웃 keratinocytes 그들의 제품을 배포 하는 멜 라 닌 합성 공장. 피부에 멜 라 닌을 생산 하 고 melanocytes의 melanosomal 구획에 저장 dendrites 통해 표 피에에서 인접 keratinocytes에 수송 된다.
L-티로신 melanogenesis 및 효소 tyrosinase 초기 기판 catalyzes L-티로신 그리고 dopaquinone로 3, 4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)으로 변환 하는 두 개의 연속 반응을 제공 합니다. 이러한 반응 속도 제한 단계 melanogenesis5,6에 있습니다. 따라서, hypopigmentation 활동 세포 tyrosinase 활동을 직접 평가 하 여 먼저 측정할 수 있습니다. 이렇게 하려면 melanocyte 추출 tyrosinase를 포함 하는 인 큐베이 팅 DOPA와 및 dopaquinone 샘플에서 475에 분 광 광도 법으로 측정 될 수 있다 nm. 값은 샘플, 및 컨트롤에 비해 적은 dopaquinone 형성에 hypopigmentation 활동 결과와 물질의 단백질 농도 의해 정규화 됩니다.
둘째, hypopigmentation 활동 교양된 melanocytes에 멜 라 닌을 직접 측정 하 여 측정할 수 있습니다. 시험 체와 세포 치료, 후 멜 라 닌 알칼리 조건 하에서 추출 되 고 멜 라 닌 콘텐츠 400 분 광 광도 법으로 정량 nm. Hypopigmentation 에이전트 컨트롤7보다 더 낮은 melanin 내용을 발생 합니다.
마지막으로, hypopigmentation 활동 폰 타나-마 송 melanin 얼룩 및 후속 이미지 분석 하 여 측정할 수 있습니다. 폰 타나-마 송 얼룩에 멜 라 닌과 립을 보이는 검은 금속 상태로 암모니아-실버 질산염을 줄일 하 고 미세한 이미지 셀의 검정 영역은 멜 라 닌의 양을 나타내며.
Hypopigmentation 에이전트 보통 제공 일관 되 고 비교 결과이 세 가지 방법으로는 물질의 활동 올바른지 확인 합니다. 또는, 그것은 주요 유전자와 단백질 melanogenesis hypopigmentation 활동을 조사 하는 시험 물질에 대 한 응답에서에 식을 측정 하기 유용할 수 있습니다. Tyrosinase, 뿐만 아니라 tyrosinase 관련 (TRP-1) 단백질과 dopachrome tautomerase (TRP-2) melanogenesis8에 중요 한 효소는. 녹음 방송 요인 microphthalmia 관련 된 전사 요소 (MITF) melanogenesis는 유전자/단백질 식 레벨의 정량화에 마스터 레 귤 레이 터 또는 발기인 활동 분석 결과 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 교양된 melanocytes을 사용 하 여 테스트의 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위한 프로토콜을 제시. 대표 결과 알 부 틴, 저해 tyrosinase 활동 및 셀룰러 멜 라 닌 콘텐츠 tyrosinase 억제 물의 hypopigmentation 효과를 보여주었다. 이러한 메서드는 안티 melanogenic 활동 연구에 널리 사용 됩니다. 이 분석 실험을 사용 하 여, 또한 성공적으로 확인 했습니다 melanogenesis B16F10 세포에 억제 효과 과거에는 여러 가?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 한국 연구소의 계획과 기술 음식, 농업 및 임업 (IPET) 농업, 음식, 및 농촌 업무 (MAFRA 투자 농업-한국 기술 개발 프로그램을 통해에 대 한 평가 의해 지원 되었다 ) (116159-02-2-WT011) BK21 플러스, 고려 대학교 생명 공학 및 생명 과학의 학교.
Materials
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
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