تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين
Summary
يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة للترادف الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن التسلسل (تشيب-Seq) التي تمكن من تحليل الخلية-نوع معين على نطاق الجينوم هستون تعديل.
Abstract
تنظيم جينية يلعب الأدوار المركزية في التعبير الجيني. منذ اكتشفت هستون تعديل في الستينات، بوظائفها الفسيولوجية والمرضية وقد درست على نطاق واسع. والواقع أن ثورة ظهور الجيل التالي تسلسل العميق وإيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) عن طريق محددة هستون تعديل الأجسام المضادة رأينا التنظيم جينية عبر الجينوم. على العكس من ذلك، الأنسجة وعادة ما تتألف من أنواع الخلايا المختلفة، وعن خليط معقد تحديات تحليلية للتحقيق في ابيجينومي في نوع خلية معينة. لمعالجة حالة الكروماتين الخاصة بنوع الخلية في طريقة على نطاق الجينوم، وضعنا مؤخرا جنبا إلى جنب الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن التسلسل (تشيب-Seq)، الذي يرتكز على تنقية انتقائية من الكروماتين بالبروتينات هستون المعلمة الأساسية من الخلية أنواع المصالح، متبوعاً بما يليها رقاقة والهدف من هذا البروتوكول هو الأخذ بممارسات أفضل لما يليها تشيب هذا الأسلوب يوفر أداة متعددة الاستخدامات للتحقيق ابيجينومي الخاصة بالانسجة في التعديلات هيستون المتنوعة ونموذج الكائنات الحية.
Introduction
تتكون أنسجة حيوانات من أنواع مختلفة من الخلايا. تنظيم الجينات في كل خلية يعرف نوع الخلية. التعديلات الكروماتين-الحمض النووي مثلايشن وهستون تعديل-تكمن وراء خصوصية خلية من نوع التعبير الجيني. وهكذا، قد تم المطلوب قياس التنظيم جينية في كل نوع من أنواع الخلايا، ولكن كان تحديا تقنيا.
للتحقيق في التخلق في نوع خلية معينة، كان جنبا إلى جنب الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن التسلسل (تشيب-Seq) وضعت مؤخرا (رقم 1)1. في تشيب، يعبر عن معلم حانمه الأساسية هيستون البروتين H2B من مروج الخلية-نوع معين. تسمح هذه الميزة لعزل تشروماتينس من الخلايا ذات الاهتمام، على الرغم من أن المواد يبدأ من خليط أنواع مختلفة من الخلايا. رقاقة-Seq التالية — تنقية الكروماتين عبر مارك هستون تعديل والجيل التالي تسلسل العميق لعزل الحمض النووي – يمكننا رصد حالة جينية من نوع الخلية المستهدفة بطريقة المجين على نطاق المنظومة.
باستخدام هذا الأسلوب، ونحن مؤخرا التحقيق تريميثيليشن الخاصة بالخلايا العصبية من هستون البروتين H3 على يسين 4 (H3K4me3) علامات. في تلك الدراسة، قمنا بتطوير تدق بماوس في أي ج-الميؤوس من شفائهم H2B معلم العلم وأعرب البروتين عند اقترانها بوساطة لجنة المساواة العرقية (Rosa26كاج فلوكسيد-السلطة الفلسطينية H2B العلم). بالعبور بماوس حيازة الجينات الشبكة (ER) Cre اندوبلاسميك تحت سيطرة المروج CamK2a، المستحث السطر الماوس التي يتم الحصول عليها العلم H2B في الخلايا العصبية نشطة على تاموكسيفن حقن (Camk2aالعلم H2B)1. بدءاً من دماغ السطر الماوس ثابتة، أجرينا Seq تشيب مع الأجسام المضادة H3K4me3. إذ كثيرا ما تتوافق مع علامات H3K4me3 إلى مناطق المروج، يمكن أن نكتشف مئات مرناس أعرب على وجه التحديد في الخلايا العصبية1.
هنا، يمكننا وصف أسلوب Seq تشيب نموذجية التي تغطي الخطوات من تشريح الأنسجة لبناء مكتبة (رقم 1). والهدف النهائي من هذا البروتوكول حصة لدينا أفضل الممارسات من أجل أداء Seq تشيب وتطبيق هذا الأسلوب مستقبلا للتعديلات هيستون وأنواع الخلايا الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكان لدينا بروتوكول الأمثل للخلايا العصبية للدماغ الماوس، وفيه التعبير عن معلم العلم H2B هو الناجم عن الحقن بعقار تاموكسيفين. المروجين المستخدمة للتعبير H2B وانطلاق مواد الأنسجة وكمية الأنسجة معلمات محورية لنجاح تشيب–ما يليها وبالتالي، ينبغي النظر في الاستفادة المثلى من هذه العوامل لكل خ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر جميع أعضاء المختبر ايواساكي لقراءة نقدية من المخطوطة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا معونات “البحث العلمي” في “مجالات مبتكرة” (26113005 # للتعطيل و JP17H05679 للصك القانوني)؛ معونات للعلماء الشباب (أ) (JP17H04998 للصك القانوني) من وزارة التربية والتعليم والعلوم، والرياضة، والثقافة من اليابان (يأمرون)؛ والمشاريع بيونيرينج “تطور الهاتف الخلوي”، وجميع المشاريع بتبريد “المرض وابيجينومي” من بتبريد (للتعطيل والصك القانوني).
Materials
| Protein LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | For cell lysis |
| Protein LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | For ChIP and library preparation |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | For ChIP and library preparation |
| 8-strip PCR tube | BIO-BIK | 3247-00 | For ChIP and library preparation |
| SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation |
| Metal bullet | TOKKEN | SK-100-DLC10 | Accessory of SK Mill |
| 2 mL stainless steel tube | TOKKEN | TK-AM5-SUS | An option for cell lysis |
| 2 mL stainless steel tube holder | TOKKEN | SK-100-TL | An option for cell lysis |
| 16% formaldehyde (w/v), methanol-free | Pierce | 28906 | To fix cells. Prepare 1% solution before use. |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-35 | Prepare 2.5 M stock |
| D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | For washing lysate and purified DNA |
| HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock. |
| 5 M NaCl, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 06900-14 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| 0.5 M EDTA, molecular biology grade | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| Glycerol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 072-04945 | For lysis buffer 1 |
| NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | For lysis buffer 1 |
| Triton X-100, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 12967-32 | For Lysis buffer 1 |
| Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock. |
| 0.1 M EGTA pH neutral | Nacalai Tesque | 08947-35 | For Lysis Buffer 2 |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | To block degradation of protein |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89900 | For cell lysis and washing |
| milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator |
| Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 or E220 | To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq |
| UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | For ChIP Elution Buffer |
| RNase A | Nacalai Tesque | 30141-14 | To purify DNA from lysate |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001 | To purify DNA from lysate |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | Make 70% solution |
| Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | To purify chromatin expressed in cells of interest |
| Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP |
| Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | Any other antibody that works for ChIP analysis will work |
| 10x Blocking Reagent | Sigma-Aldrich | 11096176001 | For blocking during affinity purification |
| Denhardt’s solution | Nacalai Tesque | 10727-74 | For blocking during affinity purification |
| Glycogen (5 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | To purify DNA from lysate |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | For quantification of isolated DNA |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For quantification of isolated DNA |
| 0.5 mL tube | Axygen | 10011-830 | For quantification by Qubit |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | To purify DNA from lysate |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | SPRI magnetic beads for library preparation |
| Metal ice rack | Funakoshi | IR-1 | To keep the cell lysate frozen |
| Sample Cooler | New England Biolabs | T7771S | Helps fix cells with minimal damage |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used. |
| Bioanalyzer 2100 Expert Software | Agilent Technologies | G2946CA | Supplied with the Bioanalyzer |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | To check the quality of the isolated DNA fragments |
| KAPA LTP Library Preparation Kit | Roche | 07961898001 | Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution |
| NEXTflex DNA Barcodes | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix. |
| KAPA Real-Time Library Amplification Kit | Roche | 07959028001 | Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards |
| 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA |
| 386-well qPCR plate | Thermo Fisher Scientific | 4309849 | For real-time PCR |
| QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4485701 | To quantify DNA |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | For real-time PCR |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | For plate sealing |
| End-repair master mix | Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O | ||
| A-taling master mix | Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O | ||
| Ligation buffer mix | Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O | ||
| Real-time PCR master mix | Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O | ||
| PCR master mix | Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O | ||
| Integrative Genomics Viewer | Broad Institute | IGV_2.3.88 | Genome browser to visualize sequencing data |
| DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR420L | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
| Thermal Cycler Dice | Takara | TP870 | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
References
- Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143 (2018).
- Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957 (2017).
- Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
- Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905 (2013).
- Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149 (2016).
- Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064 (2015).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
