TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma
Summary
Se describe un protocolo paso a paso para cromatina tándem inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq) que permite el análisis de modificaciones específicas del tipo de célula genoma histona.
Abstract
Regulación epigenética juega un papel central en la expresión génica. Puesto que la modificación de las histonas se descubrió en la década de 1960, sus funciones fisiológicas y patológicas se han estudiado ampliamente. De hecho, la llegada de próxima generación secuenciación profunda e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) mediante anticuerpos de modificación específica de la histona ha revolucionado nuestra visión de la regulación epigenética a través del genoma. Por el contrario, tejidos consisten en típicamente tipos celulares diferentes, y su mezcla compleja plantea desafíos analíticos a investigar el epigenoma en un tipo de célula particular. Para abordar el estado de cromatina tipo específico de célula en forma de genoma, recientemente desarrollamos tándem cromatina inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq), que se basa en la purificación selectiva de la cromatina por las proteínas de histona etiquetado núcleo de célula tipos de interés, seguido por ChIP-seq. El objetivo de este protocolo es la introducción de mejores prácticas de tChIP-SS. Esta técnica proporciona una herramienta versátil para la investigación de tejidos específicos epigenoma en modificaciones de las histonas diversas y organismos modelo.
Introduction
Los tejidos de los animales consisten en tipos de células diferentes. La regulación del gene en cada célula define el tipo de célula. Modificaciones de la cromatina – ADN metilación e histona modificación – ser la base de la especificidad del tipo de la célula de la expresión génica. Así, la medición de la regulación epigenética en cada tipo de célula ha sido deseada, pero ha sido un desafío técnico.
Para investigar la epigenética en un tipo de célula particular, la secuencia de inmunoprecipitación de cromatina tándem (tChIP-Seq) fue recientemente desarrollado ()figura 1)1. En tChIP, proteína núcleo etiquetado del epítopo de histona H2B se expresa de un promotor de la célula-tipo-específico. Esta característica permite el aislamiento del chromatins de las células de interés, aunque el material comienza a partir de una mezcla de diversos tipos celulares. Siguiente ChIP-Seq, purificación de la cromatina a través de una marca de histonas modificadas y secuenciación profunda generación de aislado ADN, podemos monitorear el estado epigenético del tipo objetivo de la célula en forma de todo el genoma.
Usando esta técnica, hemos investigado recientemente la trimetilación de neurona-específica de la histona H3 proteína en lisina 4 (H3K4me3) marcas. En ese estudio, desarrollamos un ratón knock-in en que C-terminal H2B tagged bandera proteína se expresó sobre recombinación mediada por la Cre (Rosa26CAG floxed pA H2B-bandera). Por cruce con un ratón que poseen el gen Cre-endoplasmic del endoplásmico (ER) bajo el control del promotor CamK2a, la línea de ratón obtenidos induce H2B-bandera en neuronas activas sobre tamoxifeno inyección (Camk2aH2B-bandera)1. A partir de cerebro de la línea de ratón establecido, realizamos tChIP-Seq con anticuerpo anti-H3K4me3. Desde marcas H3K4me3 corresponden a menudo a regiones promotoras, podríamos descubrir cientos de mRNAs expresado específicamente en las neuronas1.
Aquí, describimos un método típico tChIP-Seq que cubre los pasos de la disección del tejido a la construcción de la biblioteca ()figura 1). El objetivo final de este protocolo es compartir nuestras mejores prácticas para la ejecución de tChIP-Seq y la futura aplicación de este método a otros tipos celulares y modificaciones de las histonas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro protocolo se ha optimizado para las neuronas del cerebro de ratón, en el que la expresión de tagged bandera H2B es inducida por inyección de tamoxifeno. Promotores para expresión H2B, partida materiales de tejido y la cantidad de los tejidos son parámetros fundamentales para éxito tChIP-SS. Por lo tanto, la optimización de estos factores debe considerarse para cada tipo de célula de interés.
Un paso fundamental entre los procedimientos utilizados en el presente Protocolo es el…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Iwasaki para lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (26113005 # S.N. y JP17H05679 a S.I.); subvenciones para jóvenes científicos (A) (JP17H04998 a S.I.) del Ministerio de educación, ciencia, deportes y cultura de Japón (MEXT); y la pionera proyectos “Evolución celular” y todos los proyectos RIKEN “Enfermedad y epigenoma” de RIKEN (a MATR y S.I.).
Materials
| Protein LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | For cell lysis |
| Protein LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | For ChIP and library preparation |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | For ChIP and library preparation |
| 8-strip PCR tube | BIO-BIK | 3247-00 | For ChIP and library preparation |
| SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation |
| Metal bullet | TOKKEN | SK-100-DLC10 | Accessory of SK Mill |
| 2 mL stainless steel tube | TOKKEN | TK-AM5-SUS | An option for cell lysis |
| 2 mL stainless steel tube holder | TOKKEN | SK-100-TL | An option for cell lysis |
| 16% formaldehyde (w/v), methanol-free | Pierce | 28906 | To fix cells. Prepare 1% solution before use. |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-35 | Prepare 2.5 M stock |
| D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | For washing lysate and purified DNA |
| HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock. |
| 5 M NaCl, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 06900-14 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| 0.5 M EDTA, molecular biology grade | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| Glycerol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 072-04945 | For lysis buffer 1 |
| NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | For lysis buffer 1 |
| Triton X-100, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 12967-32 | For Lysis buffer 1 |
| Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock. |
| 0.1 M EGTA pH neutral | Nacalai Tesque | 08947-35 | For Lysis Buffer 2 |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | To block degradation of protein |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89900 | For cell lysis and washing |
| milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator |
| Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 or E220 | To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq |
| UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | For ChIP Elution Buffer |
| RNase A | Nacalai Tesque | 30141-14 | To purify DNA from lysate |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001 | To purify DNA from lysate |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | Make 70% solution |
| Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | To purify chromatin expressed in cells of interest |
| Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP |
| Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | Any other antibody that works for ChIP analysis will work |
| 10x Blocking Reagent | Sigma-Aldrich | 11096176001 | For blocking during affinity purification |
| Denhardt’s solution | Nacalai Tesque | 10727-74 | For blocking during affinity purification |
| Glycogen (5 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | To purify DNA from lysate |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | For quantification of isolated DNA |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For quantification of isolated DNA |
| 0.5 mL tube | Axygen | 10011-830 | For quantification by Qubit |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | To purify DNA from lysate |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | SPRI magnetic beads for library preparation |
| Metal ice rack | Funakoshi | IR-1 | To keep the cell lysate frozen |
| Sample Cooler | New England Biolabs | T7771S | Helps fix cells with minimal damage |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used. |
| Bioanalyzer 2100 Expert Software | Agilent Technologies | G2946CA | Supplied with the Bioanalyzer |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | To check the quality of the isolated DNA fragments |
| KAPA LTP Library Preparation Kit | Roche | 07961898001 | Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution |
| NEXTflex DNA Barcodes | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix. |
| KAPA Real-Time Library Amplification Kit | Roche | 07959028001 | Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards |
| 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA |
| 386-well qPCR plate | Thermo Fisher Scientific | 4309849 | For real-time PCR |
| QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4485701 | To quantify DNA |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | For real-time PCR |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | For plate sealing |
| End-repair master mix | Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O | ||
| A-taling master mix | Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O | ||
| Ligation buffer mix | Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O | ||
| Real-time PCR master mix | Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O | ||
| PCR master mix | Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O | ||
| Integrative Genomics Viewer | Broad Institute | IGV_2.3.88 | Genome browser to visualize sequencing data |
| DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR420L | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
| Thermal Cycler Dice | Takara | TP870 | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
References
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