Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Klinisk protokol producere fedtvæv-afledte stromale vaskulære brøkdel for potentielle brusk regenerering

Published: September 29, 2018 doi: 10.3791/58363
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 2, 2, 2, 2
1Mipro Medical Clinic, 2National Leading Research Laboratory, Department of Biological Sciences, Myongji University
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at producere en fedtvæv-afledte stromale vaskulære fraktion og dens anvendelse til at forbedre knæ funktioner ved at regenerere brusk-lignende vævet i menneskelige patienter med slidgigt.

Abstract

Osteoarthritis (OA) er en af de mest almindelige invaliderende lidelser. For nylig er sket talrige forsøg på at forbedre funktionerne i knæene ved hjælp af forskellige former for mesenchymale stamceller (msc). I Korea, knoglemarv koncentrater og ledningen er blod-afledte stamceller blevet godkendt af Korean Food and Drug Administration (KFDA) til brusk regenerering. Derudover har en fedtvæv-afledte stromale vaskulære brøkdel (SVF) fået lov af KFDA for fælles indsprøjtninger i menneskelige patienter. Autolog fedtvæv-afledte SVF indeholder ekstracellulære matrix (ECM) ud over mesenkymale stamceller. ECM udskiller forskellige cytokiner, der sammen med hyaluronsyre (HA) og trombocyttal-rich plasma (PRP) aktiveret af calcium chlorid, kan hjælpe MSCs at regenerere brusk og forbedre knæ funktioner. I denne artikel præsenterede vi en protokol for at forbedre knæ funktioner ved at regenerere brusk-lignende vævet i menneskelige patienter med OA. Resultatet af protokollen blev først rapporteret i 2011 efterfulgt af et par supplerende publikationer. Protokollen indebærer Fedtsugning for at opnå autologe lipoaspirates, der er blandet med collagenase. Denne lipoaspirates-collagenase blanding er derefter klippe og homogeniseret for at fjerne store fibrøst væv, der kan tilstoppe nålen under injektionen. Bagefter er blandingen udruget for at opnå fedtvæv-afledte SVF. Den resulterende fedtvæv-afledte SVF, der indeholder både fedtvæv-afledte MSCs og resterne af ECM, sprøjtes ind i knæ af patienter, kombineret med HA og calciumchlorid aktiveret PRP. Inkluderet er tre tilfælde af patienter, der blev behandlet med vores protokol, hvilket resulterer i forbedringer af knæet smerter, hævelse og vifte af bevægelse sammen med Mr bevis for hyaline brusk-lignende væv.

Introduction

Mesenchymale stamceller (msc) er kendt for at have kapacitet til at regenerere brusk1,2,3,4,5,6. De let kan fremskaffes fra forskellige kilder: knoglemarven, navlestrengsblod og fedtvæv blandt mange andre. Blandt disse kilder er fedtvæv den eneste kilde, hvor et tilstrækkeligt antal MSCs kan fås uden nogen kultur udvidelse til at regenerere brusk i klinisk indstillinger7,8. Autolog knoglemarv stromale vaskulære brøkdel (SVF) kan nemt opnået så godt. Antallet af stamceller, der er indeholdt i ikke-kultur udvidet marv er imidlertid meget lav7,8. Navlestrengsblod kan indeholde et tilstrækkeligt antal MSCs. Navlestrengsblod er imidlertid ikke en let tilgængelig kilde til autolog SVF.

Talrige metoder til forarbejdning fedtvæv at opnå SVF er tilgængelige til kliniske applikationer. Blandt disse metode til at opnå MSCs fra fedtvæv bruger collagenase, udviklet og bekræftet af Zuk et al. 5 , 6, er blevet meget godt modtaget. Denne metode til at bruge collagenase er blevet ændret til kliniske applikationer i ortopædi. For at blive anvendt til kliniske indstillinger, skal være et lukket system til at opretholde steriliteten samtidig holde bekvemmelighed. En bestemt ændring præsenteret i denne artikel omfatter homogenisering af lipoaspirates. Lille størrelse lipoaspirates er fordøjet relativt hurtigere end de større, resulterer i en ujævn fordeling af fedtvæv. Desuden kan disse større mellemstore lipoaspirates producere fibrøst væv, der kan tilstoppe sprøjter og nåle mens de udfører fælles indsprøjtninger9,10. For at undgå disse problemer, kan lipoaspirates homogeniseret ved skæring og hakkes lipoaspirates før inkubation med collagenase. Den resulterende fedtvæv-afledte SVF kan indeholde mere ensartet ekstracellulære matrix (ECM) i forhold til lipoaspirates, der ikke er homogeniseret11. Den havarerede ECM indeholdt i SVF kan arbejde som et stillads12.

I 2009, er autologe fedtvæv-afledte SVF tilladt af Korean Food and Drug Administration (KFDA) når behandles inden for en medicinsk facilitet med minimal behandling af en læge13. Bagefter, autolog fedtvæv-afledte SVF har været udnyttet som en potentiel agent til at forbedre knæ funktion i osteoarthritis (OA) patienter af potentielt regenerere brusk-lignende væv10,14,15 , 16 , 17 , 18 .

I 2011 viste Pak for første gang at fedtvæv-afledte stamceller (ASCs) indeholdt i fedtvæv-afledte SVF kan forbedre knæ funktioner potentielt regenerere brusk-lignende vævet i menneskets OA patienter når injiceres med trombocyt-rige plasma (PRP) 14. Derudover har Pak et al. rapporteret sikkerhedsdata i 2013 der involverer 91 patienter. Den gennemsnitlige effektivitet sats rapporteret i dette sikkerhedsdatablad var 67%15. Efterfølgende yderligere undersøgelser af Pak et al. viste forbedret knæ funktioner potentielt på grund af brusk-lignende væv revitalisering hos patienter med en menisken tåre og chondromalacia patellae10,16,17 ,18. Baseret på artikel rapporteret, er det kendt, at antallet af stamceller i 100 g af fedtvæv behandles af den protokol, der er præsenteret i denne artikel kan variere fra 1.000.000-40.000.000 afhængigt af patienters karakteristika8, 19 , 20 , 21 , 22 , 23.

Vi præsenterer her, en klinisk protokol af menneskelige knæ OA ved hjælp af autologe fedtvæv-afledte SVF med HA og PRP aktiveret med calciumchlorid. Den første version af denne klinisk protokol, der involverer en lukket, manuel system for at bevare steriliteten, blev rapporteret i 201114. Identiske protokollen blev optimeret, opretholde sterilitet, og blev rapporteret i 2013 og 201610,15. Her præsenteres den optimerede protokol. Den skematiske oversigt over protokollen er præsenteret i figur 1.

Figure 1
Figur 1: skematisk oversigt over protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Godkendelse af og tilladelse til at rapportere følgende kasuistikker frafaldet ved Myongji Universitet institutionelle Review Board udvalg (MJUIRB). Yderligere, denne klinisk protokol var i overensstemmelse med retningslinjerne af Helsinki-erklæringen og regulering af KFDA. For procedurer, blev informeret samtykke opnået fra patienterne.

1. Fedtsugning

Bemærk: Udføres med steril teknik.

  1. Brug de følgende inklusionskriterierne: (1) Mr beviser af trin 3 OA; (2) enten mandlig eller kvindelig; (3) over 18 år af alder; (4) tilstrækkelig (100-110 g) fedtvæv for fedtsugning; (5) uvilje til at fortsætte med kirurgisk indgreb; (6) svigt i konservative ledelse; og (7) løbende invaliderende smerter.
  2. Brug de følgende udelukkelseskriterier: (1) aktive inflammatoriske eller bindevæv sygdommen menes at påvirke smerte tilstand (dvs., lupus, leddegigt, fibromyalgi); (2) aktive endokrine lidelse, der kan påvirke smerte tilstand (dvs.,, hypothyreose, diabetes); (3) aktive neurologisk lidelse, der kan påvirke smerte tilstand (dvs.,, perifer neuropati, multipel sklerose); (4) aktive lungesygdom der kræver medicin forbrug; og (5) ingen historie af steroid fælles indsprøjtninger seneste 3 måneder.
  3. Bringer patienten i en operationsstue med biohazard klasse A hætte og placere ham (eller hende) i en liggende stilling.
  4. Rengør den abdominale område af patienten med 5% betadine (povidon-jod) og drapere patienten ved hjælp af steril teknik, udsætter det rensede område af maven for fedtsugning.
  5. Ca. 5 cm infero-lateralt fra umbilicus, bedøver to lokaliteter (ene på venstre og den anden på højre side af navlen) af indsnit til-være-lavet ved hjælp af 2 mL 2% lidocain uden adrenalin med en (25 gauge, 1½ tomme) kanyle i en 5-mL sprøjte ved at indsprøjte hvert websted på den epidermale plan.
  6. Bedøver site af indsnit til-være-foretages med 5 mL af tumescent opløsning (500 mL af normale saltvand, 40 mL 2% lidocain, 20 mL 0,5% bupivacaine, 0,5 mL af 1:1000 adrenalin) i en 10-mL sprøjte med en nål (25 gauge, 1½ tomme).
  7. Gøre 2 snit af 0,5 cm ca. 5 cm under navlen lateralt ved at klemme huden for at øge dybden af det subkutane niveau.
  8. Bruger nr. 11 blade, stikke hævet huden til at trænge igennem til den subkutane niveau, men ikke at trænge ind gennem bugvæggen.
  9. Ved hjælp af 20 cm 16-gauge kanyle, bedøver den subkutane niveau af området hele nedre abdomen, som er til-være-liposuctioned, med 700-800 mL af tumescent.
  10. Efter endt infiltration af hele underlivet med tumescent løsningen, forberede en Fedtsugning apparater ved at tilslutte en 3,0 mm kanyle tilsluttet en 60 mL (eller en 30 mL) sprøjten til manuel Fedtsugning eller en specialdesignet 3,0 mm kanyle tilsluttet en centrifuge kit, en lukket system sprøjte med henblik på at holde sterilitet, tilsluttet en vakuum maskine til vakuum-assisted Fedtsugning.
  11. Udføre Fedtsugning for at få 100-110 g fedtvæv undtagen tumescent løsning. Når du udfører fedtsugning, opnås fedtvæv sammen med den tumescent løsning, som bør være adskilt og fjernet.
  12. For at adskille den tumescent løsning, først ved hjælp af tyngdekraften, overføre fedtvæv i centrifuge kit til en 60 mL sprøjte og læg sprøjten ned (dvs. del af sprøjten er nederst). Af venter 5-6 min, vil fedtvæv og tumescent væsken være adskilt. Fjerne væske i bunden af sprøjten ved at trykke på den øverste del af sprøjten stemplet.
  13. Udføre trinene ovenfor 1.9-1.11, indtil alt 100-110 g af fedtvæv (lipoaspirates) pr. knæ er blevet akkumuleret.

2. forberedelse af ASC/ECM blanding med sterilt lukket System

  1. Efter adskillelse af tumescent løsning af tyngdekraften og akkumulere 50-55 g af lipoaspirates pr. hver 60 mL centrifugeres kit, et sterilt lukket system, placere 2 centrifuge kits i en centrifuge container spand og spin på 1600 x g i 5 min, kondenserende de lipoaspirates og adskille væske fra fedtvæv. I denne proces med yderligere kondenserer, lipoaspirates kan producere fede olie i visse tilfælde.
  2. At være forsigtig ikke at ryste, fjerne sikkerhed cap og stikket i bunden af centrifuge kit.
  3. Fjern bunden væske ved langsomt at trykke ned på toppen af stemplet af centrifuge kit.
  4. På separate 60 mL sprøjte, 10 mg collagenase (5 mg af collagenase specifikke for bindevæv24 ) og 5 mg af collagenase specifikke for fedtvæv25med 50 mL af normale saltvand opløses.
  5. Bland ca 25-30 mL af kondenseret lipoaspirate med opløst collagenase (5 mg af collagenase specifikke for bindevæv) og 5 mg af collagenase specifikke for fedtvæv i forholdet 1:1 (v: v) ved at forbinde 60 mL sprøjten til en centrifuge kit ved hjælp af en specialiseret stik.
  6. Blandes grundigt i kondenseret lipoaspirate og collagenase ved at skubbe indholdet mellem 60 mL sprøjte og centrifugeres kits ved hjælp af en stang eller en pusher.
  7. Overfør blandingen af lipoaspirate og collagenase tilbage til 60 mL sprøjter.
  8. Tilslut hver 60 mL sprøjte indeholdende blanding med et væv homogeniseringsapparat, som indeholder vinger.
  9. Tilsluttes anden enden af homogeniseringsapparat en tom 60 mL sprøjte.
  10. Tryk blandingen til andre 60 mL sprøjten gennem homogeniseringsapparat for 4 -6 gange, hvilket resulterer i skæring og hakning af lipoaspirate.
  11. Overføre den homogeniseret lipoaspirate og collagenase blandingen tilbage til 60 mL centrifugeres kits gennem en specialiseret stik
  12. Anbring centrifuge kits i en beholder skal placeres i en inkubator, der har været forvarmet ved 37 ° C.
  13. Inkuber to centrifuge kits med den homogeniseret blanding ved 37 ° C i 40 min mens roterende på 45 rpm.
  14. Efter 40 min inkubation, skal du fjerne containeren fra inkubator i en steril mode. Derefter fjerne centrifuge kits og placere dem i en centrifuge maskine.
  15. Der centrifugeres blandinger ved 800 x g i 5 min at adskille det fedtvæv-afledte SVF.
  16. Efter centrifuge, Fjern supernatanten (som omfatter collagenase og fordøjet fedtvæv) fra hver centrifuge kits ved at fjerne sprøjten cap på toppen af stemplet og placere en 30 mL sprøjte på stemplet åbning via sprøjte lås forbindelsen.
  17. Langsomt Tryk ned tønde del af 30 mL sprøjten til supernatanten at fylde ind i 30 mL sprøjten.
  18. Tryk på ned til 30 mL sprøjte tønde hele vejen ned til de sidste 3-4 mL af bunden af centrifuge kit, forlader kun de sidste 3-4 mL af fedtvæv-afledte SVF. Supernatanten er kasseret.
  19. Fjerner 30 mL sprøjten fra toppen af stemplet og fyld sprøjten med 5% dextrose i laktat Ringers løsning (D5LR).
  20. Ved at knytte den 30 mL sprøjte fyldt med D5LR på toppen af stemplet åbne, udfylde de centrifuge møntsæt 3-4 mL af fedtvæv-afledte SVF, med D5LR op til 55 mL.
  21. Fjerner 30 mL sprøjten, cap stemplet og centrifugeres centrifuge kits igen ved 300 x g i 4 min.
  22. Gentag trin 2.17-2.21 for i alt 4 vask. Den anvendte collagenase er xenogen. Derfor, de fleste collagenase er fjernet af 4 vask. For FDA godkendelse, kan finjustering af protokollen dog være nødvendigt helt at fjerne collagenase rester i det endelige rumfang, selv om den aktuelle mængde collagenase rester kan være ubetydelig nok for de patienter, der ikke har nogen klinisk bivirkninger.
  23. Efter de 4th centrifugering, for at opnå den endelige SVF injektionsvæske, fjerne sikkerhed cap og stik på den nederste åbning af centrifuge kit, uden at ryste eller dreje centrifuge kit.
  24. Vedhæfte en 20 mL sprøjte til centrifuge kit bunden åbning ved hjælp af en specialdesignet stik.
  25. Træk stemplet sprøjte flere gange frem og tilbage til at ryste op de celler, der har afgjort på bunden af centrifuge kit.
  26. Fjerne den ønskede samlede volumen af SVF indeholdende både ASCs og ECM sammen med andre celler og væv (normalt omkring 3-4 mL fra hver centrifuge kit til knæ fælles indsprøjtninger).

3. PRP forberedelse med steril teknik

  1. Samtidig med at forberede ASCs og ECM, tegne 30 mL af autologt blod med 2,5 mL antikoagulerende citratopløsning dextrose.
  2. Overføre den udtrukne blod til 60 mL centrifugeres kits.
  3. Centrifugeres trukket blod på 730 x g i 5 min og Fjern supernatanten ind i en ny 60 mL centrifugeres kit. Der centrifugeres supernatanten ved 1300 x g i 4 min., hvilket resulterer i 3-4 mL af PRP.
  4. Lige før injektionen, tilføje 3% (w/v) calciumchlorid i forholdet 10:2 (PRP: calciumchlorid, v: v) til PRP at aktivere den.
  5. Tilføje 0,5% (w/v) HA, som et stillads, at PRP aktiveret med calciumchlorid. Disse ASCs med ECM, sammen med PRP, aktiveret af calcium chlorid, og HA står for ASC/ECM blanding.

4. ASC/ECM blanding-baseret behandling

  1. Ren knæ af patienten med 5% betadine og drapere det i en steril måde.
  2. Palpere den forreste af knæ for den fælles rum mellem de tibial og femoral knogler.
  3. Bedøver injektionsstedet overfladisk med fortyndet lidocain (1 mL 1% lidocain fortyndet med 4 mL af normale saltvand) fra huden til at lige uden for ledkapslen.
  4. Bedøver indersiden af ledkapslen med fortyndet ropivacaine (1 mL 0,75% ropivacaine fortyndet med 3 mL af normale saltvand).
  5. Bland 2 mL HA til 6-8 mL af SVF indeholdt i en 20 mL sprøjte gennem sprøjten til sprøjte-stik.
  6. Ved hjælp af en sprøjte til at sprøjte connector, skal du tilføje 0,4 mL calciumchlorid til 3-4 mL autolog PRP, der allerede er udarbejdet og være klar i en 5-mL sprøjte.
  7. Kombinere 3,5-4,5 mL PRP/calciumchlorid i en 5 mL sprøjte med 8-10 mL af HA/SVF blandingen i en 20 mL sprøjte via sprøjte til at sprøjte stik.
  8. Straks injicere blanding (ca 12-15 mL) langsomt ind i anterior tibio-femorale fælles i knæene ved hjælp af 38-mm 18-gauge kanylen med eller uden ultralyd vejledning.
  9. Efter injektionen, forbinding injektionsstedet med pres ved at folde 4 x 4 bomuld gaze 4 gange og placere bånd over den foldede 4 x 4 gaze.
  10. Bed patienten om at forblive stadig for 60 min. til celle vedhæftet fil.
  11. Bed patienten om at begrænse aktiviteter for minimal af 1 uge efter udskrivelsen fra klinikken.
  12. Tilbage til klinikken for tre yderligere injektioner af PRP aktiveret af calcium chlorid over 3 uger.

5. efter behandling opfølgning

  1. Vurdere patienten på uge 2, 4 og 16 (18 eller 22) for smerte forbedring med hensyn til visuel analog skala (VAS) og funktion forbedringer med hensyn til fysioterapi parametre. Bestemme funktionelle rating indeks (Fre), VAS og vifte af bevægelse (ROM) som tidligere beskrevet26,27.
  2. Følge patienten ved efterbehandling Mr 3 måneder efter behandlingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tre patienter (en 87-årig kvinde med stage 3 OA, en 68-årig mand med fase 3 OA, og en 60-årig kvinde med stage 3 OA) uden nogen betydelig tidligere sygehistorie fremlagt på klinikken med vedvarende knæsmerter og ønskede for potentiale autolog fedtvæv-afledte SVF behandling. Alle tre patienter havde deres knæ undersøgt af en ortopædkirurg og blev tilbudt at have knæalloplastik (TKR) og var tilbageholdende med at have kirurgi. Før proceduren, havde alle tre patienter modtaget flere injektioner af steroider og HA uden nogen langvarig forbedring.

Den 87-årige koreanske kvindelig patient, på tidspunktet for undersøgelsen, klagede over stærke smerter (VAS score på 8; Figur 2A) mens der på resten. Hun beskrev smerten til at være stigende ([fre: 37; Figur 2A) Når du går op og ned ad trappen. På fysisk eksamen, blev der konstateret mild fælles hævelse med nedsat ROM og ømhed med fleksion (figur 2B). Dog blev ingen ligament slaphed værdsat. Mcmurrays og Apley's tests var negative. En før-behandling MRI viste en nedsat størrelse mediale menisk deformation og maceration. (Figur 2 c, 2E, 2 Gog 2I).

Den anden patient, en 68-årige koreanske mand, klagede over alvorlige venstre knæsmerter (VAS score: 7; Figur 3A) mens der på resten. Smerten (fre: 33; Figur 3A) blev beskrevet som stiger når man går op og ned ad trappen. På fysisk eksamen var der mild deformitet med mild fælles hævelse. ROM (figur 3B) var faldet. Yderligere, ingen ligament slaphed blev værdsat. Mcmurrays og Apley's tests var negative. En før-behandling MRI viste brusk udtynding sammen med en nedsat størrelse og deforme mediale menisk sekundært til den tidligere meniscectomy (figur 3 c, 3E, 3 Gog 3I). Patienten blev diagnosticeret til at have stage 3 OA.

Den tredje patient, en 60-year-old koreansk kvinde, også rapporteret smerter (VAS score: 8; Figur 4A) på resten. Smerten (fre: 36; Figur 4A) blev beskrevet som stiger når man går. Patienten havde også mild knæet hævelse og nedsat ROM (figur 4B). Ingen ligament slaphed blev værdsat. Mcmurrays og Apley's tests var negative. En før-behandling MRI viste faldt størrelse mediale menisk med deformation og maceration, og der var brusk udtynding (figur 4 c, 4E, 4 Gog 4I).

Behandlingsplan. Alle tre repræsentative patienter blev begrænset fra at tage steroider, aspirin, non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID) og asiatiske naturlægemidler medicin mindst 1 uge før proceduren. Efter indtagelse af Mr imaging studier, blev lipoaspirates fremstillet og behandlet som der henvises til ovenfor. Bagefter, den autologe fedtvæv-afledte SVF indeholdende ASCs, ECM, HA og calcium-chlorid-aktiverede autolog PRP blev sprøjtet til knæene på dag 0. Der var ingen komplikationer på grund af liposuctions og fælles indsprøjtninger. Efterfølgende, tilbage patienterne til klinikken i en uge, derefter 2 uger, og derefter 3 uger for yderligere injektioner af HA og autologe PRP aktiveret med calciumchlorid.

Resultat. Efter den anden uge af ASC/ECM blanding injektion forbedret den 87-årige kvindelige patientens smerter og ROM (figur 2A og 2B). Af de 16 uge, patientens smerter og ROM væsentligt forbedret med mere end 70% (figur 2A og 2B). Efterbehandling Mr taget efter 16 uger viste øget tykkelsen af hyaline brusk-lignende vævet på den mediale side af knæet (figur 2D, 2F, 2 Hog 2J). Sammenligning var den gennemsnitlige effektivitet 67% i data ved hjælp af denne klinisk protokol, der involverer 91 patienter og rapporteret i 201315.

Figure 2
Figur 2: resultatet af smerte målinger (A) og vifte af motion, litra b og Mr sagittal (C-F) og koronale (G-J) sekventielle T2 udsigt over knæet fra patient tilfældet 1. * angiver et statistisk signifikant resultat (p < 0,05). Forbehandling Mr-scanninger (C: sekventielle billede, 5/20; E: 6/20; G: 10/20; og jeg: 11/20) viser brusken læsioner (pile). Efterbehandling MR scanner på 16 uger (D: 6/20; F: 7/20; H: 10/20; og Jørgensen: 11/20) angive brusk-lignende vævsregeneration (pilespids) der er blevet repareret af ASC/ECM blanding-baseret behandling. Dette tal er blevet ændret fra den foregående betænkning af Pak et al. 10. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Den 68-årige mandlige patientens smerter og ROM forbedret efter den anden uge af ASC/ECM blanding injektion (figur 3A og 3B). Af de 18th uge, hans smerte og ROM yderligere forbedret betydeligt til 80% (figur 3A og 3B). Gentagne Mr taget efter 18th uge viste en stigning i højden af hyaline brusk-lignende vævet på den forreste mediale side af knæet (figur 3D, 3F, 3 H og 3J).

Figure 3
Figur 3 : Resultatet af smerte målinger (A) og vifte af motion b og Mr sagittal (C-F) og koronale (G-J) sekventielle T2 udsigt over knæet fra patient tilfældet 2. * angiver et statistisk signifikant resultat (p < 0,05). Forbehandling Mr-scanninger (C: sekventielle billede, 6/20; E: 7/20; G: 13/20; og jeg: 14/20) viser brusken læsioner (pile). Efterbehandling MR scanner på 16 uger (D: 6/20; F: 7/20; H: 13/20; og Jørgensen: 14/20) angive brusk-lignende vævsregeneration (pilespids) der er blevet repareret af ASC/ECM blanding-baseret behandling. Dette tal er blevet ændret fra den foregående betænkning af Pak et al. 10. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Den 60-årige kvindelige patientens smerter og ROM forbedret ca 50% efter den anden uge af ASC/ECM blanding injektion, (figur 4A og 4B). Uge 22nd forbedret smerte og ROM væsentligt over 80% (figur 4A og 4B). Gentagne Mr taget efter 22nd uge viste en stigning i højden af hyaline brusk-lignende vævet på den mediale side af knæet (figur 4D, 4F, 4 Hog 4J).

Figure 4
Figur 4 : Resultatet af smerte målinger (A) og vifte af motion, litra b og Mr sagittal (C-F) og koronale (G-J) sekventielle T2 udsigt over knæet fra patient tilfældet 3. * angiver et statistisk signifikant resultat (p < 0,05). Forbehandling Mr-scanninger (C: sekventielle billede, 4/20; E: 5/20; G: 10/20; og jeg: 11/20) viser brusken læsioner (pile). Efterbehandling MR scanner på 16 uger (D: 4/20; F: 5/20; H: 10/20; og Jørgensen: 11/20) angive brusk-lignende vævsregeneration (pilespids) der er blevet repareret af ASC/ECM blanding-baseret behandling. Dette tal er blevet ændret fra den foregående betænkning af Pak et al. 10. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I 2001, Zuk mfl. isolerede stamceller fra fedtvæv ved at nedbryde kollagen matrix med collagenase6. Bagefter, gruppen viste, at disse stamceller isoleret fra fedtvæv kunne omdanne brusk og andre væv af mesoderm oprindelse, at bevise, at disse stamceller var mesenchymale oprindelse.

Ligeledes, den procedure, der er præsenteret i denne artikel er en modificeret protokol at anvende den samme metode til menneskelige patienter. Den vigtigste ændring af protokollen er inkorporering i lukket system sprøjter til fremskaffelse og forarbejdning af lipoaspirates for at minimere luft kontakten samtidig opretholde lethed af udførelse af proceduren. Brug af sådanne lukkede system sprøjter, blev fedtvæv opnået via Fedtsugning. Derefter, lipoaspirates blev blandet med collagenase i lukket system sprøjter. Bagefter, collagenase blev fjernet fra blandingen ved at fortynde collagenase koncentration inden for de lukkede system sprøjter. Slutresultatet er en steril fedtvæv-afledte SVF opnåede med lethed af processen.

Ved hjælp af samme metode, viste Pak i 2011, for første gang, at autologe fedtvæv-afledte SVF kan bruges til at behandle OA patienter af potentielt regenerere brusk-lignende væv. Senere, Pak mfl. viste også, kan at autologe fedtvæv-afledte SVF bruges til at behandle menisk tåre og chondromalacia patellae ved regenerere brusk-lignende bindevæv og hyaline brusk-lignende væv, henholdsvis. I 2013, Pak mfl. rapporteret en sikkerhedsundersøgelse involverer 91 patienter behandlet med autologe fedtvæv-afledte SVF. Undersøgelsen rapporterede gennemsnitlige effektivitet var 67%, bane vejen til mulighed for at anvende autolog fedtvæv-afledte SVF generelt patientgruppe med brusk skader.

En af de mest almindelige bivirkninger rapporteret af Pak mfl. i 2013 var sikkerhedsundersøgelse efter behandling knæ fælles hævelse, der kan forklares med 1) stamceller død, 2) betændelse af røde blodlegemer indeholdt i PRP, og/eller 3) resterende collagenase, der er forblevet i den endelige mængden af fedtvæv-afledte SVF. Da MSC'er findes inden for ECM fedtvæv11,12, er fordøje lipoaspirates med collagenase at nedbryde matrix at lease stamcellerne en bindende proces12. Men efter nedbryde matrix til at frigive stamcellerne, de resterende resterende collagenase bør fuldt fjernes fra endelige mængden for at forhindre enhver potentiel betændelse, der kan fremstilles af de resterende collagenase28. Selvom collagenase kan forårsage betændelse, kan en ubetydelig mængde af collagenase i den endelige mængden af fedtvæv-afledte SVF ikke udløse en fælles hævelse. Sådanne endelige mængden af autologe fedtvæv-afledte SVF med en ubetydelig mængde af collagenase har været anvendt sikkert for de sidste par år til behandling af OA i knæ ved regenerere brusk-lignende væv.

For nylig har to ikke-enzymatiske metoder til at opnå fedtvæv-afledte SVF været indført29,30. Disse metoder udnytte enten mekanisk kraft eller ultralyd (vibrationelle) kraft, i stedet for collagenase. I 2018, D'Ambrosi mfl. rapporterede et resultat af behandling af fire osteochondral læsioner af talus i anklen med mikro-brækket, renset autolog fedtvæv, er opnået ved hjælp af mekanisk kraft til opdeling matrix29. Ingen collagenase blev brugt til at nedbryde matrixen. Fire patienter blev behandlet med fedtvæv mikro-brækket, (dvs., mekanisk havarerede fedtvæv), for deres talus29. Alle disse fire patienter viste kliniske forbedring seks måneder efter indgrebet. Ingen havde nogen komplikationer. Men denne undersøgelse29var der ingen rapport af potentielle regenerering af brusk. En anden undersøgelse offentliggjort involverer vibrationelle energi i år viste, at vibrationelle energi i visse frekvens ikke var tilstrækkelige til at isolere stamceller30.

Som vist ovenfor, har forskellige grupper forskellige protokoller for at bruge en autolog fedtvæv til behandling af forskellige degenerative fælles lidelser. Protokollen kan variere fra størrelsen af kanylen anvendes til fedtsugning, mængden af fedtvæv bruges, type og mængde af collagenase (hvis nogen), metode til injektioner, og så videre. Da MSC'er findes inden for ECM af fedtvæv, kan effekten af collagenase eller rensning metode ved hjælp af mekaniske kræfter, spille en vigtig rolle. Især kan effektiviteten af collagenase afhænge af faktorer som størrelse af fedtvæv, mængden af fedtvæv, koncentration af collagenase, tid og temperatur af inkubationen med collagenase, og processen med at fjerne rester collagenase, som kan forårsage celle skader28.

Det skal bemærkes, at collagenase, da det er en vigtig del af denne procedure til at fremstille stamceller der indeholder fedtvæv-afledte SVF, kan have en negativ effekt på den endelige mængden af fedtvæv-afledte SVF. I denne procedure, er collagenase blandet med kondenseret lipoaspirates, homogeniseret, udruget og derefter vaskes. I hele denne proces, er stamceller udsat for collagenase, som kan have en skadelig virkning på overlevelse af stamceller28. For meget koncentration eller langvarig udsættelse af collagenase kan sænke stamcelle levedygtighed i de endelige rumfang28. Yderligere, for meget af collagenase tilbage i det endelige rumfang kan forårsage betændelse i leddet da collagenase kan nedbryde brusken matrix af den fælles injiceres28.

Ud over de potentielle negative virkninger af collagenase, kan Fedtsugning bære andre potentielle komplikationer. For at opnå fedtvæv-afledte SVF, skal Fedtsugning udføres først. Udfører liposuctions, som andre medicinske procedurer, bærer nogle potentielle komplikationer såsom uregelmæssigheder i huden kontur, seromas, infektion, perforering af bugvæggen, nekrotiserende fasciitis, fat blodprop og lungeemboli. Blandt disse komplikationer er hud contour uregelmæssigheder en meget almindelig bivirkning, der let kan forebygges ved hjælp af små cannulas og undgå overfladiske liposuctions31,32. Seromas, som er en samling af serøs væske i suctioned-området, kan også være et resultat af aggressive Fedtsugning33. Andre potentielle komplikationer såsom infektion, nekrotiserende fasciitis, perforering af abdominal vægge, fat blodprop eller lungeemboli er alt muligt. Disse komplikationer kan dog også forebygges ved hjælp af strenge sterile teknikker og ved at forbedre patientens compliance34.

Yderligere, alle tre patienter inkluderet i undersøgelsen oprindeligt præsenteret med en mild fælles effusion, et klart tegn på synovitis. Efter behandling med fedtvæv-afledte SVF, alle disse fælles hævelse forbedret patienter. Derfor er det også rimeligt at antage, at en forbedring af kliniske symptomer er ikke mulige brusk regenerering, men i stedet den modulerende og anti-inflammatoriske effekt af stamceller og/eller PRP på ledhinden35 , 36. Alternativt symptom forbedring kan være bidraget til både modulerende og anti-inflammatoriske virkning af stamceller og/eller PRP på ledhinden sammen med mulige regenerering af brusk-lignende væv. Selv om mere forskning er nødvendig for at afgrænse den sande mekanisme af symptom forbedring, homogeniseret denne perkutan intra-artikulær injektion af celleterapi i form af autologe, fedtvæv-afledte SVF med autolog PRP aktiveret med calciumchlorid og/eller HA kan tilbyde en alternativ behandling til den nuværende strategi for behandling af knæ OA.

Som for tilsætning af autologe PRP er bekymret, det er almindeligt accepteret at PRP indeholder forskellige vækstfaktorer og differentiering faktorer for injiceres MSC'er til at vokse og differentiere37,38,39. PRP har også vist sig for at have en neutraliserende virkning40collagenase. Med hensyn til tilføjelsen af hyaluronsyre har (HA), HA vist sig at have en potentiel rolle som stilladser materiale, på grund af sin høje affinitet til brusk væv, og en potentiel rolle at hjælpe stamceller i gennemtrængende brusk matrix41.

Da flere nye processer for at opnå fedtvæv-afledte SVF er tilgængelige, er en optimering af en metode til behandling af lipoaspirates nødvendigt at standardisere processen. Dette kan dog være en vanskelig opgave på grund af antallet af mulige variationer i processen med at opnå og forarbejdning autolog fedtvæv-afledte SVF. For eksempel, kan forskelle i tekstur af subkutane fedtvæv i enkelte patient, som følge af ældning eller graden af overvægt, have forskellige svar til collagenase aktiviteter, hvilket resulterer i et forskelligt antal ASCs i autologt fedt væv-afledte SVF42. Derudover antallet af stamceller i hvert gram af fedtvæv kan adskille sig fra en patient til den anden som det fremgår af den store variation af rapporterede stamcelle numre i talrige publikationer7,19,20, 21 , 22 , 23.

Denne protokol fremlagde i denne artikel er en roman, innovative procedure, forsøger at forbedre den nuværende strategi til behandling af menneskelige knæ OA af potentielt regenerere brusk-lignende vævet med perkutan injektioner af autologe fedtvæv-afledte SVF. Den korrekte brug af collagenase er et vigtigt og afgørende skridt i denne protokol. Ved hjælp af lukkede system sprøjter til at holde sterilitet, samtidig opretholde bekvemmeligheden for at udføre proceduren er større ændring af den protokol, udviklet af Zuk mfl. 5 desuden for anvendelse på mennesker, den resterende mængde collagenase indeholdt i den endelige fedtvæv-afledte SVF bør ubetydelige til at forhindre enhver ledinflammation. Der er begrænsninger i denne protokol: collagenase rester i det endelige rumfang (selv om dette kan være ubetydelig), ingen kontrol grupper, der enkeltvis injiceres PRP og HA, ingen biopsier, intet undtagen forbedring af kliniske symptomer på grund af PRP, lille antallet af patienter (pilotundersøgelse), ingen trodser komponenter af fedtvæv-afledte SVF, og ingen angivelse af antallet af stamceller i hver af de 3 patienter. Anvende fedtvæv-afledte SVF for lidelser, såsom en menisken tåre, chondromalacia patellae, diskus lidelser, en forsinket heling (eller ikke-healing) knogle fraktur, en ikke-healing hud sår, brystrekonstruktion, og andre medicinske lidelser kan forbedre den kliniske udfald. Selv om disse potentielle kliniske anvendelser af fedtvæv-afledte SVF, er mere grundig og energisk kliniske undersøgelser nødvendige for at indarbejde fedtvæv-afledte SVF i faktiske kliniske indstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatteren erkender støtte fra personale Mipro Lægeklinik og figur design af Jaepil/David Lee. Dette arbejde blev støttet af forskningstilskud fra Bio & medicinsk teknologi Development Program af NRF finansieret af MSIT (antal NRF-2017M3A9E4078014); og den nationale forskning fundament af Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab og IKT (numre NRF-2017R1A2B4002315 og NRF-2016R1C1B2010308).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
5% Betadine (povidone-iodine)  Firson Co., Ltd. 657400260
2% Lidocaine  Daehan Pharmaceutical Co. 670603480
Tumescent solution  Myungmoon Pharm. Co. Ltd. N01BB01 The solution was composed of 500 mL normal saline, 40 mL 2% lidocaine, 20 mL 0.5% marcaine, and 0.5 mL epinephrine 1:1000.
Liberase TL and TM research grade  Roche Applied Science 5401020001
D5LR Dahan Pharm. Co., Ltd. 645101072 Dextrose 5% in lactated Ringer's solution 
Anticoagulant citrate dextrose solution  Fenwal, Inc. NDC:0942-0641 The solution was composed of 0.8% citric acid,
0.22% sodium citrate, and 0.223% dextrose.
3% (w/v) Calcium chloride  Choongwae Pharmaceutical Co. 644902101
0.5% (w/v) HA (Hyaluronic acid ) Dongkwang pharm. Co., Ltd. 645902030
0.25% Ropivacaine Huons Co., Ltd. 670600150
Equipment
3.0 mm Cannula  WOOJU Medical Instruments Co. ML30200
60-mL Luer-Lock syringe BD (Becton Dickinson)  309653
Centrifuge Barrel Kit  CPL Co., Ltd. 30-0827044
Tissue homogenizer that contains blades CPL Co., Ltd. 30-0827045
Rotating incubator mixer Medikan Co., Ltd MS02060092
Centrifuge Hanil Scientific Inc. CE1133
Magnetic Resonance Imaging Philips Medical Systems Inc. 18068
Ultrasound Imaging System Samsung Medison co., Ltd CT-LK-V10-ICM-09.05.2007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnoczky, S. P. Building a meniscus. Biologic considerations. Clinical Orthopaedics and Related Research. (367 Suppl), S244-S253 (1999).
  2. Barry, F. P. Mesenchymal stem cell therapy in joint disease. Novartis Foundation Symposium. 249, 86-241 (2003).
  3. Usuelli, F. G., et al. Adipose-derived stem cells in orthopaedic pathologies. British Medical Bulletin. 124 (1), 31-54 (2017).
  4. Zhang, H. N., Li, L., Leng, P., Wang, Y. Z., Lv, C. Y. Uninduced adipose-derived stem cells repair the defect of full-thickness hyaline cartilage. Chinese Journal of Traumatology. 12 (2), 92-97 (2009).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  7. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
  8. Zhu, Y., et al. Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC. Cell Biochemistry and Function. 26 (6), 664-675 (2008).
  9. Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports. 7 (1), 10015 (2017).
  10. Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. Regeneration of Cartilage in Human Knee Osteoarthritis with Autologous Adipose Tissue-Derived Stem Cells and Autologous Extracellular Matrix. BioResearch Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).
  11. Alexander, R. W. Understanding Adipose-derived Stromal Vascular Fraction (AD-SVF) Cell Biology and Use on the Basis of Cellular, Chemical, Structural and Paracrine Components: A Concise Review. Journal of Prolotherapy. 4, e855-e869 (2012).
  12. Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
  13. Korean Food and Drug Administration (KFDA). Cell therapy: Rules and Regulations. KFDA. , (2009).
  14. Pak, J. Regeneration of human bones in hip osteonecrosis and human cartilage in knee osteoarthritis with autologous adipose-tissue-derived stem cells: a case series. Journal of Medical Case Reports. 5, 296 (2011).
  15. Pak, J., Chang, J. J., Lee, J. H., Lee, S. H. Safety reporting on implantation of autologous adipose tissue-derived stem cells with platelet-rich plasma into human articular joints. BMC Musculoskeletal Disorders. 14, 337 (2013).
  16. Pak, J., Lee, J. H., Kartolo, W. A., Lee, S. H. Cartilage Regeneration in Human with Adipose Tissue-Derived Stem Cells: Current Status in Clinical Implications. BioMed Research International. 2016, 4702674 (2016).
  17. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. A novel biological approach to treat chondromalacia patellae. PLoS One. 8 (5), e64569 (2013).
  18. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells. BioMed Research International. 2014, 436029 (2014).
  19. Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
  20. De Ugarte, D. A., et al. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow. Cells Tissues Organs. 174 (3), 101-109 (2003).
  21. Guilak, F., et al. Clonal analysis of the differentiation potential of human adipose-derived adult stem cells. Journal of Cellular Physiology. 206 (1), 229-237 (2006).
  22. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  23. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  24. Liberase TL information available from Sigma Millipore online. , https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US (2018).
  25. Liberase TM information available from Sigma Millipore online. , https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/Libtmro?lang=en®ion=US (2018).
  26. Childs, J. D., Piva, S. R. Psychometric properties of the functional rating index in patients with low back pain. European Spine Journal. 14 (10), 1008-1012 (2005).
  27. Price, D. D., McGrath, P. A., Rafii, A., Buckingham, B. The validation of visual analogue scales as ratio scale measures for chronic and experimental pain. Pain. 17 (1), 45-56 (1983).
  28. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicine. 3 (5), 705-715 (2008).
  29. D'Ambrosi, R., Indino, C., Maccario, C., Manzi, L., Usuelli, F. G. Autologous Microfractured and Purified Adipose Tissue for Arthroscopic Management of Osteochondral Lesions of the Talus. Journal of Visualized Experiments. (131), e56395 (2018).
  30. Packer, J. D., Chang, W. T., Dragoo, J. L. The use of vibrational energy to isolate adipose-derived stem cells. Plastic Reconstructive Surgery-Global Open. 6 (1), e1620 (2018).
  31. Hanke, C. W., Bernstein, G., Bullock, S. Safety of tumescent liposuction in 15,336 patients. National survey results. Dermatologic Surgery. 21 (5), 459-462 (1995).
  32. Illouz, Y. G. Complications of liposuction. Clinics in Plastic Surgery. 33 (1), 129-163 (2006).
  33. Dixit, V. V., Wagh, M. S. Unfavourable outcomes of liposuction and their management. Indian Journal of Plastic Surgery. 46 (2), 377-392 (2013).
  34. Lehnhardt, M., et al. Major and lethal complications of liposuction: a review of 72 cases in Germany between 1998 and 2002. Plastic and Reconstructive Surgery. 121 (6), 396e-403e (2008).
  35. Iyer, S. S., Rojas, M. Anti-inflammatory effects of mesenchymal stem cells: novel concept for future therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (5), 569-581 (2008).
  36. Zhang, J., Middleton, K. K., Fu, F. H., Im, H. J., Wang, J. H. HGF mediates the anti-inflammatory effects of PRP on injured tendons. PLoS One. 8 (6), e67303 (2013).
  37. Li, N. Y., Yuan, R. T., Chen, T., Chen, L. Q., Jin, X. M. Effect of platelet-rich plasma and latissimus dorsi muscle flap on osteogenesis and vascularization of tissue-engineered bone in dogs. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 67 (9), 1850-1858 (2009).
  38. Parsons, P., et al. The biological effect of platelet rich-plasma on the fracture healing process. The Journal of bone and joint surgery. British volume. 91-B, 293 (2009).
  39. Wu, W., Chen, F., Liu, Y., Ma, Q., Mao, T. Autologous injectable tissue-engineered cartilage by using platelet-rich plasma: experimental study in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 65 (10), 1951-1957 (2007).
  40. Cooper, T. W., Eisen, A. Z., Stricklin, G. P., Welgus, H. G. Platelet-derived collagenase inhibitor: characterization and subcellular localization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2779-2783 (1985).
  41. Uzuki, M., Sawai, T. A. A comparison of the affinity of sodium hyaluronate of various molecular weights for degenerated cartilage: a histochemical study using hyaluronic acid binding protein. International Congress Series. 1223, 279-284 (2001).
  42. Pagano, C., et al. Molecular and morphometric description of adipose tissue during weight changes: a quantitative tool for assessment of tissue texture. International Journal of Molecular Medicine. 14 (5), 897-902 (2004).

Tags

Medicin sag 139 medicin fedtvæv-afledte stamceller ekstracellulære Matrix menneskelige brusk regenerering slidgigt regenerativ medicin mesenkymale stamceller
Klinisk protokol producere fedtvæv-afledte stromale vaskulære brøkdel for potentielle brusk regenerering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pak, J., Lee, J. H., Pak, N. J.,… More

Pak, J., Lee, J. H., Pak, N. J., Park, K. S., Jeon, J. H., Jeong, B. C., Lee, S. H. Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (139), e58363, doi:10.3791/58363 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter