En Hyperandrogenic musen Model til at studere polycystisk ovariesyndrom
Summary
Vi beskriver udviklingen af et lean PCOS-lignende musemodel med dihydrotestosteron pellet at studere Patofysiologi af PCOS og afkom fra disse PCOS-lignende dæmninger.
Abstract
Hyperandrogenemia spiller en afgørende rolle i reproduktiv og metabolisk funktion hos kvinder og er kendetegnende for polycystisk ovariesyndrom. Udvikle en lean PCOS-lignende musemodel, der efterligner kvinder med PCOS er klinisk meningsfulde. I denne protokol beskriver vi sådan en model. Ved at indsætte en 4 mm længde af DHT (dihydrotestosteron) krystal pulver pellet (totallængde pellet er 8 mm), og erstatte det månedlige, vi er i stand til at producere en PCOS-lignende musemodel med serum DHT niveauer 2 gange højere end mus ikke implanteret med DHT (no-DHT). Vi observerede reproduktiv og metabolisk dysfunktion uden at ændre kropsvægt og kropssammensætning. Mens udviser en høj grad af infertilitet, en lille delmængde af disse PCOS-lignende hunmus kan blive gravide og deres afkom Vis forsinket pubertet og øget testosteron som voksne. Denne PCOS-lignende musemodel for lean er et nyttigt værktøj til at studere Patofysiologi af PCOS og afkom fra disse PCOS-lignende dæmninger.
Introduction
Hyperandrogenism er kendetegnende for polycystisk ovariesyndrom (PCOS) Ifølge NIH kriterier og af Androgen overskydende og PCOS (AE-PCOS) samfund. Kvinder med PCOS har svært ved at blive gravid og har øget risiko for graviditet komplikationer1. Selv hvis de bliver gravid, har deres kvindelige afkom en sundhedsskadelige resultater2,3. Dyremodeller er blevet udviklet ved hjælp af forskellige strategier4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 og udstiller mange funktioner af PCOS (anovulation, og/eller nedsat glukose og insulin tolerance) med øget kropsvægt og fedme forbundet med øget adipocyt vægt og udvidede adipocyt størrelse. Der er to store strategier til at producere dyremodeller, der bruges til at studere PCOS. En er behandling med høje niveauer af androgener direkte (eksogene androgen indsprøjtning/indsættelse) eller indirekte (f.eks. blokering androgen konvertering til østrogen med aromatasehæmmer) efter fødsel13. En anden er af føtal hyperexposure af androgener under drægtigheden14,15 at studere afkommet. For eksempel, udvikle kvindelige afkom fra rhesus abe16,17, får18og gnavere udsat for mandlige androgen intrauterin periode PCOS-lignende træk senere i livet. Disse modeller betydeligt udvidet vores forståelse af forhøjede androgen virkning, og føtal programmering og uterin miljøvirkninger. Men disse modeller har deres egne begrænsninger: 1) dyr udvikler fedme og det er derfor vanskeligt at adskille virkningerne af hyperandrogenemia fra fedme induceret reproduktiv og metabolisk dysfunktion; 2) før graviditeten, kvinder med PCOS udstille allerede høje niveauer af androgen, således oocyter har været udsat for androgen overskydende før befrugtningen; 3) de farmakologiske doser af testosteron (T) eller dihydrotestosteron (DHT) anvendes efter fødslen eller under drægtigheden kan ikke afspejle androgen miljøet af PCOS. Testosteron og DHT niveauer er blevet målt i æggestokkene follikulært væske og/eller serum, og testosteron og DHT niveauer er 1,5 til 3,9 gange højere hos kvinder med PCOS5,19,20,21 ,22,23 sammenlignet med kvinder, upåvirket. Vi skabt en voksen mus model23,24,25 , udvikler reproduktiv og metabolisk dysfunktion senest to uger efter indledningen af kronisk DHT eksponering fra indsættelse af en pellet med 4 mm længde krystal DHT pulver (totallængde pellet er 8mm). Denne model producerer serum DHT niveauer, der er om 2-fold højere (benævnt 2xDHT) end kontrol mus uden DHT behandling. 2xDHT mus, udviser ikke ændringer af basal serum østradiol, testosteron, LH og ikke udvikle fedme, og Vis lignende æggestokkene vægt, serumniveauer af kolesterol, frie fedtsyrer, leptin, TNFα og IL-623,24, 25 forhold til styrer selv op til 3,5 måneder efter DHT Indsættelse23,24,25. Derudover ved parring hundyr, der allerede har udviklet funktioner af PCOS, kan vi studere virkningen af en hyperandrogenic maternel miljø på den metaboliske og reproduktiv sundhed af afkom15.
Dette nye paradigme (relevant for NIH og AE-PCOS samfund kriterier) modeller sygdommen ved at producere forholdsvis ensartede niveauer af androgener til dem af kvinder med PCOS 2 – til 3-fold højere testosteron eller DHT niveauer i forhold til upåvirket kvinder. Men denne model vedligeholdes af løbende eksogene DHT og ikke fra programmeret endogene hyperandrogenism når DHT er trukket tilbage. Det overordnede mål med denne artikel er at fokusere på 1) hvordan man laver DHT pellet; 2) Hvordan til at generere en lean-PCOS som musen model; 3) strategier til at evaluere kvindelige afkom fra disse dæmninger. Andre målinger og vurdering af fænotyper er ikke behandlet i dette manuskript, men kan findes i5,15,23,24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hyperandrogenism er et centralt element af PCOS. Serum DHT niveauer (to folde højere i DHT mus end i no-DHT mus) anvendes i denne protokol er lavere end dem, der indberettes af andre efterforskere i tidligere undersøgelser og er kalibreret til at efterligne forholdsmæssigt kvinder med PCOS5,19, 20,21. I modsætning til andre modeller, er denne 2-fold DHT model ændrer ikke kropsvægt og hel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (tilskud R00-HD068130 til S.W.) og Baltimore Diabetes Research Center: piloter og gennemførlighed Grant (til S.W.).
Materials
| Crystalline 5α-DHT powder | Sigma-Aldrich | A8380-1G | ||
| Dow Corning Silastic tubing | Fisher Scientific | 11-189-15D | 0.04in/1mm inner diameter x0.085in/2.15mm outer diameter | |
| Medical adhesive silicone | Factor II, InC. | A-100 | ||
| Goggles, lab coats, gloves and masks. | ||||
| 10 µL pipette tips without filter | USA Scientific | 11113700 | ||
| Microscope slide for smear | Fisher Scientific | 12-550-003 | ||
| Diff Quik for staining cells | Fisher Scientific | NC9979740 | ||
| Lancet | Fisher Scientific | NC9416572 | ||
| 3 mL Syring | Becton, Dickinson and Company (BD), | 30985 | ||
| attached needle: 20G | BD | 305176 | ||
| Ruler: any length than 10cm with milimeter scale. | ||||
| Xylazine | Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise | NDC13985-704-10 | 100mg/ml | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira, Inc | NDC 0409-2051-05 | 100mg/ml | |
| Surgical staple | AutoClip® System, Fine Science Tool | 12020-00 | ||
| Insulin syringe | BD | 329461 | 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe | |
| Trochar | Innovative Research of America | MP-182 | ||
| Microscope | Carl Zeiss Primo Star | 415500-0010-001 | Germany | |
| Ear punch | Fisher Scientific | 13-812-201 | ||
| Testosterone rat/mouse ELISA kit | IBL | B79174 | ||
| DHT ELISA kit | Alpha Diagnostic International | 1940 | ||
| One touch ultra glucometer | Life Scan, Inc. | |||
| One touch ultra test stripes | Life Scan, Inc. | |||
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-18 | ||
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | ||
| Clidox | Fisher Scientific | NC0089321 | ||
| surgical underpad | Fisher Scientific | 50587953 | 
|
|
| Betadine Antiseptic Solution | Walgreens | |||
| 3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) | 3M Science. Applied to Life | |||
| Animal tattoo ink paste | Ketchum manufacturing Inc. | Brockville, Ontario, Canada | ||
| Scale | Ohaus Corporation | HH120D | Pine Brook, NJ | |
| Electronic digital caliper | NEIKO Tools USA | 01407A | available from Amazon |
References
- Palomba, S., de Wilde, M. A., Falbo, A., Koster, M. P., La Sala, G. B., Fauser, B. C. Pregnancy complications in women with polycystic ovary syndrome. Hum. Reprod. Update. 21 (5), 575-592 (2015).
- Doherty, D. A., Newnham, J. P., Bower, C., Hart, R. Implications of polycystic ovary syndrome for pregnancy and for the health of offspring. Obstet. Gynecol. 125 (6), 1397-1406 (2015).
- de Wilde, M. A., et al. Cardiovascular and Metabolic Health of 74 Children From Women Previously Diagnosed With Polycystic Ovary Syndrome in Comparison With a Population-Based Reference Cohort. Reprod. Sci. , (2018).
- Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
- van Houten, E. L., Kramer, P., McLuskey, A., Karels, B., Themmen, A. P., Visser, J. A. Reproductive and metabolic phenotype of a mouse model of PCOS. Endocrinology. 153 (6), 2861-2869 (2012).
- Cardoso, R. C., Puttabyatappa, M., Padmanabhan, V. Steroidogenic versus Metabolic Programming of Reproductive Neuroendocrine, Ovarian and Metabolic Dysfunctions. Neuroendocrinology. 102 (3), 226-237 (2015).
- Dumesic, D. A., Abbott, D. H., Padmanabhan, V. Polycystic ovary syndrome and its developmental origins. Rev. Endocr. Metab Disord. 8 (2), 127-141 (2007).
- Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol Reprod. 93 (3), 69 (2015).
- Kelley, S. T., Skarra, D. V., Rivera, A. J., Thackray, V. G. The Gut Microbiome Is Altered in a Letrozole-Induced Mouse Model of Polycystic Ovary Syndrome. PLoS One. 11 (1), e0146509 (2016).
- Kafali, H., Iriadam, M., Ozardali, I., Demir, N. Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat: a new model for cystic ovarian disease. Arch. Med. Res. 35 (2), 103-108 (2004).
- Maliqueo, M., Benrick, A., Stener-Victorin, E. Rodent models of polycystic ovary syndrome: phenotypic presentation, pathophysiology, and the effects of different interventions. Semin. Reprod. Med. 32 (3), 183-193 (2014).
- Yanes, L. L., et al. Cardiovascular-renal and metabolic characterization of a rat model of polycystic ovary syndrome. Gend. Med. 8 (2), 103-115 (2011).
- Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol. Reprod. 93 (3), 69 (2015).
- Filippou, P., Homburg, R. Is foetal hyperexposure to androgens a cause of PCOS?. Hum. Reprod. Update. 23 (4), 421-432 (2017).
- Wang, Z., Shen, M., Xue, P., DiVall, S. A., Segars, J., Wu, S. Female Offspring From Chronic Hyperandrogenemic Dams Exhibit Delayed Puberty and Impaired Ovarian Reserve. Endocrinology. 159 (2), 1242-1252 (2018).
- Abbott, D. H., Barnett, D. K., Bruns, C. M., Dumesic, D. A. Androgen excess fetal programming of female reproduction: a developmental aetiology for polycystic ovary syndrome?. Hum. Reprod. Update. 11 (4), 357-374 (2005).
- Abbott, D. H., Dumesic, D. A., Franks, S. Developmental origin of polycystic ovary syndrome – a hypothesis. J. Endocrinol. 174 (1), 1-5 (2002).
- Padmanabhan, V., Veiga-Lopez, A. Sheep models of polycystic ovary syndrome phenotype. Mol. Cell. Endocrinology. 373 (1-2), 8-20 (2013).
- Pierre, A., et al. Dysregulation of the Anti-Mullerian Hormone System by Steroids in Women With Polycystic Ovary Syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 102 (11), (2017).
- Dumesic, D. A., et al. Hyperandrogenism Accompanies Increased Intra-Abdominal Fat Storage in Normal Weight Polycystic Ovary Syndrome Women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 101 (11), 4178-4188 (2016).
- Fassnacht, M., Schlenz, N., Schneider, S. B., Wudy, S. A., Allolio, B., Arlt, W. Beyond adrenal and ovarian androgen generation: Increased peripheral 5 alpha-reductase activity in women with polycystic ovary syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (6), 2760-2766 (2003).
- Dikensoy, E., Balat, O., Pence, S., Akcali, C., Cicek, H. The risk of hepatotoxicity during long-term and low-dose flutamide treatment in hirsutism. Arch. Gynecol. Obstet. 279 (3), 321-327 (2009).
- Ma, Y., et al. Androgen Receptor in the Ovary Theca Cells Plays a Critical Role in Androgen-Induced Reproductive Dysfunction. Endocrinology. , en20161608 (2016).
- Andrisse, S., et al. Low Dose Dihydrotestosterone Drives Metabolic Dysfunction via Cytosolic and Nuclear Hepatic Androgen Receptor Mechanisms. Endocrinology. , en20161553 (2016).
- Andrisse, S., Billings, K., Xue, P., Wu, S. Insulin signaling displayed a differential tissue-specific response to low-dose dihydrotestosterone in female mice. Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 314 (4), E353-E365 (2018).
- van Houten, E. L., Visser, J. A. Mouse models to study polycystic ovary syndrome: a possible link between metabolism and ovarian function?. Reprod. Biol. 14 (1), 32-43 (2014).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. , (2009).
- Wu, S., et al. Conditional knockout of the androgen receptor in gonadotropes reveals crucial roles for androgen in gonadotropin synthesis and surge in female mice. Mol. Endocrinol. 28 (10), 1670-1681 (2014).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
- Dinger, K., et al. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Nilsson, M. E., et al. Measurement of a Comprehensive Sex Steroid Profile in Rodent Serum by High-Sensitive Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Endocrinology. 156 (7), (2015).
- McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).
- Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats. J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).
- Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. 17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells. J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).
