Metodo autoradiografico quantitativo per la determinazione dei tassi regionali di sintesi proteica cerebrale in vivo
Summary
La sintesi proteica è un processo biologico critico per le cellule. Nel cervello, è necessario per le modifiche adattive. La misurazione dei tassi di sintesi proteica nel cervello intatto richiede un’attenta considerazione metodologica. Qui presentiamo il metodo autoradiografico quantitativo L-[1-14C]-leucina per la determinazione dei tassi regionali di sintesi delle proteine cerebrali in vivo.
Abstract
La sintesi proteica è necessaria per lo sviluppo e il mantenimento della funzione neuronale ed è coinvolta nei cambiamenti adattivi nel sistema nervoso. Inoltre, si pensa che la disregolazione della sintesi proteica nel sistema nervoso possa essere un fenotipo fondamentale in alcuni disturbi dello sviluppo. La misurazione accurata dei tassi di sintesi delle proteine cerebrali nei modelli animali è importante per comprendere questi disturbi. Il metodo che abbiamo sviluppato è stato progettato per essere applicato allo studio degli animali svegli e che si comportano. È un metodo autoradiografico quantitativo, quindi può produrre tassi in tutte le regioni del cervello contemporaneamente. Il metodo si basa sull’uso di un aminoacido tracciante, L-[1-14C]-leucina, e un modello cinetico del comportamento della L-leucina nel cervello. Abbiamo scelto L-[1-14C]-leucina come tracciante perché non porta a prodotti metabolici etichettati estranei. È incorporato nella proteina o rapidamente metabolizzato per produrre 14CO2 che viene diluito in un grande pool di CO2 senza etichetta nel cervello. Il metodo e il modello consentono anche il contributo della leucina non etichettata derivata dalla proteolisi tissutale alla pool precursore del tessuto per la sintesi proteica. Il metodo ha la risoluzione spaziale per determinare i tassi di sintesi delle proteine negli strati cellulari e neuropil, così come i nuclei ipotalici e nervosi cranici. Per ottenere dati quantitativi affidabili e riproducibili, è importante rispettare i dettagli procedurali. Qui presentiamo le procedure dettagliate del metodo quantitativo autoradiografico L-[1-14C]-leucina per la determinazione dei tassi regionali di sintesi proteica in vivo.
Introduction
La sintesi proteica è un importante processo biologico necessario per il cambiamento adattivo a lungo termine nel sistema nervoso1. L’inibizione della sintesi proteica blocca l’immagazzinamento di memoria a lungo termine sia negli invertebrati che nei vertebrati2. La sintesi proteica è essenziale per il mantenimento delle fasi tardive di alcune forme di potenziamento a lungo termine (LTP) e depressione a lungo termine (LTD)3, sopravvivenza neuronale durante lo sviluppo4, e per il mantenimento generale del neurone e della sua connessioni sinaptiche5. La misurazione dei tassi di sintesi delle proteine cerebrali può essere uno strumento importante con cui studiare i cambiamenti adattivi, nonché i disturbi e i disturbi del neurosviluppo legati all’apprendimento e alla memoria.
Abbiamo sviluppato un metodo per quantificare i tassi di sintesi proteica cerebrale in vivo in un animale sveglio che offre vantaggi intrinseci rispetto ad altre tecniche che stimano i tassi in ex vivo o in vitro preparati del tessuto cerebrale6. In primo luogo è l’applicabilità alle misurazioni nel cervello intatto in un animale sveglio. Questa è una considerazione chiave perché permette misurazioni con struttura sinaptica e funzione in atto e senza preoccupazioni circa gli effetti post mortem. Inoltre, l’approccio quantitativo autoradiografico che impieghiamo raggiunge un alto grado di localizzazione spaziale. Mentre l’energia di 14C è tale che non possiamo localizzare il tracciante a livello subcellulare o cellulare, possiamo misurare i tassi negli strati cellulari e nelle piccole regioni cerebrali come i nuclei ipotalelli, con circa 25 m risoluzione7.
Una sfida delle misurazioni in vivo con i radiotracciatori consiste nell’assicurare che il radiolabel misurato sia nel prodotto della reazione di interesse piuttosto che di precursore etichettato non reagito o di altri prodotti metabolici etichettati estranei6. Abbiamo scelto L-[1-14C]-leucina come aminoacido tracciante perché è incorporato nella proteina o rapidamente metabolizzato a 14CO2, che viene diluito nel grande pool di CO2 senza etichetta nel cervello derivante dall’alto tasso di metabolismo energetico8. Inoltre, qualsiasi 14C non incorporato nella proteina esiste principalmente come libero [14C]-leucina, che nel periodo sperimentale di 60 min, è quasi interamente eliminato dal tessuto6. Le proteine vengono quindi fissate al tessuto con formalina e successivamente sciacquate con acqua per rimuovere qualsiasi leucina libera [14C] -leucina prima dell’autoradiografia.
Un’altra considerazione importante è la questione della diluizione dell’attività specifica del pool di amminoacidi precursori da aminoacidi non etichettati derivati dalla proteolisi tissutale. Abbiamo dimostrato che nel ratto e nel topo adulti, circa il 40% del pool di leucina precursore per la sintesi proteica nel cervello proviene da amminoacidi derivati dalla ripartizione delle proteine6. Questo deve essere incluso nel calcolo dei tassi regionali di sintesi delle proteine cerebrali (rCPS) e deve essere confermato negli studi in cui questa relazione può cambiare. La base teorica e le ipotesi del metodo sono state presentate in dettaglio altrove6. In questo documento, ci concentriamo sulle questioni procedurali dell’applicazione di questa metodologia.
Questo metodo è stato impiegato per la determinazione di rCPS in scoiattoli terrestri9, pecore10, rhesus scimmie11, ratti12,13,14,15,16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 21, un modello murino del complesso Tuberoso sclerosi22, un modello murino di sindrome fragile X23,24,25,26, fragili topi X premutation27, e un modello murino di fenylketonuria28. In questo manoscritto, presentiamo le procedure per la misurazione di rCPS con il metodo leucina autoradiografico in vivo L-[1-14C]-leucina. Vi presentiamo rCPS nelle regioni cerebrali di un topo di controllo sveglio. Dimostriamo anche che la somministrazione in vivo dell’anisomicina, un inibitore della traduzione, abolisce la sintesi proteica nel cervello.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentiamo un metodo quantitativo per la determinazione dei tassi regionali di sintesi delle proteine cerebrali (rCPS) in vivo negli animali sperimentali. Questo metodo ha notevoli vantaggi rispetto ai metodi esistenti: 1. Le misurazioni vengono effettuate nell’animale che si comporta in tutto il risveglio, quindi riflettono i processi in corso nel cervello funzionante. 2. Le misurazioni sono effettuate mediante autoradiografia quantitativa che offre la capacità di determinare la rCPS in tutte le regioni e sottoregioni…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere xia zengyan per la genotipizzazione dei topi, Tom Burlin per la lavorazione di aminoacidi e film, e Mei Qin per l’esecuzione di alcuni degli esperimenti rCPS. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di Ricerca Intramurale del NIMH, EI MH00889. RMS è stata anche sostenuta da una borsa di studio per il post-dottorato 8679 per l’autismo e da una borsa di studio FRAXA Postdoctoral Fellowship.
Materials
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
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