生体内における脳タンパク質合成の局所速度の決定のための定量的自動放射線法
Summary
タンパク質合成は、細胞にとって重要な生物学的プロセスです。脳では、適応的な変化のために必要とされる。無傷の脳におけるタンパク質合成率の測定には、慎重な方法論的考慮が必要である。ここでは、生体内における脳タンパク質合成の局所速度を決定するためのL-[1-14 C]-ロイシン定量的自動放射線法を紹介する。
Abstract
タンパク質合成は、神経機能の発達と維持に必要であり、神経系の適応変化に関与しています。また、神経系におけるタンパク質合成の調節不全は、いくつかの発達障害においてコア表現型でありうって考えられている。動物モデルにおける脳タンパク質合成率の正確な測定は、これらの障害を理解するために重要である。我々が開発した方法は、目覚め、動物の振る舞いの研究に適用するように設計されました。これは定量的な自動放射線法なので、同時に脳のすべての領域で速度を得ることができます。この方法は、トレーサーアミノ酸、L-[1-14 C]-ロイシン、および脳内のL-ロイシンの挙動の運動モデルの使用に基づいている。無関係な標識代謝産物に結びつないため、トレーサーとしてL[1-14 C]-ロイシンを選びました。これは、タンパク質に組み込まれるか、または急速に代謝され、脳内の標識されていないCO2の大きなプールで希釈される14CO 2を得る。この方法およびモデルはまた、タンパク質合成のための組織前駆体プールへの組織タンパク質照症に由来する標識されていないロイシンの寄与を可能にする。この方法は、細胞および神経層におけるタンパク質合成速度、ならびに視床下部および頭蓋神経核を決定する空間分解能を有する。信頼性が高く再現可能な定量データを取得するには、手続き上の詳細に従うことが重要です。ここでは、生体内におけるタンパク質合成の局所速度を決定するための定量的自動放射線L-[1-14 C]-ロイシン法の詳細な手順を示す。
Introduction
タンパク質合成は、神経系1における長期適応変化に必要な重要な生物学的プロセスである。タンパク質合成を阻害することは、無脊椎動物と脊椎動物の両方における長期記憶貯蔵をブロックする2.タンパク質合成は、長期増強(LTP)および長期うつ病(LTD)3、開発時のニューロン生存、およびニューロンおよびその一般的な維持のために、いくつかの形態の後期段階の維持に不可欠である。シナプス接続5.脳タンパク質合成率の測定は、適応的変化だけでなく、神経発達障害や学習と記憶に関連する障害を研究するための重要なツールである可能性があります。
我々は、脳組織6のex vivoまたはインビトロ製剤の速度を推定する他の技術よりも固有の利点を提供する覚醒動物における生体内の脳タンパク質合成の速度を定量する方法を開発した。何よりも、目を覚ました動物の無傷の脳での測定への適用性です。これは、シナプス構造と機能を備えた測定を可能にし、死後の影響を気にすることなく、重要な考慮事項です。さらに、我々が採用する定量的な自動放射線アプローチは、高度な空間ローカリゼーションを達成する。14Cのエネルギーは、細胞レベルまたは細胞レベルでトレーサーを局在化できないほどですが、視床下部核などの細胞層や小脳領域の速度を測定することができ、約25μmの分解能7を持つ。
放射線トレーサーによる生体内測定の1つの課題は、測定された放射性標識が未反応標識前駆体または他の無関係標識代謝産物6ではなく、関心のある反応の産物であることを確実にすることである。トレーサーアミノ酸としてL-[1-14 C]-ロイシンを選んだのは、タンパク質に組み込まれるか、14CO2に急速に代謝され、高い割合から生じる脳内の標識されていないCO2の大きなプールで希釈されるからである。 エネルギー代謝8.さらに、タンパク質に組み込まれなかった任意の14Cは、主に自由[14C]-ロイシンとして存在し、60分の実験期間にわたって、組織6からほぼ完全にクリアされる。タンパク質は、ホルマリンで組織に固定され、その後、自己放射器の前に任意の自由[14C]-ロイシンを除去するために水ですすいでください。
もう一つの重要な考慮事項は、組織プロテオリシスに由来する標識のないアミノ酸による前駆体アミノ酸プールの特定活性の希釈の問題である。成体ラットおよびマウスにおいて、脳内のタンパク質合成のための前駆体ロイシンプールの約40%がタンパク質分解6に由来するアミノ酸に由来することを示した。これは、脳タンパク質合成(rCPS)の局所率の計算に含まれなければならず、この関係が変化する可能性のある研究で確認されなければならない。理論上の基礎と方法の仮定は、他の場所で詳細に提示されている6.本稿では,この方法論の応用の手続き上の問題点に焦点を当てる.
この方法は、地上リス9、羊10、ケサスサル11、ラット12、13、14、15、16におけるrCPSの決定のために用いられた,17歳,18歳,19歳,20歳,21、結節性硬化症複合体22のマウスモデル、脆弱X症候群23、24、25、26、脆弱X変異マウス27、およびフェニルケトン尿症28のマウスモデル。本原稿では、生体内自動放射線L-[1-14 C]-ロイシン法を用いてrCPSを測定する手順を提示する。覚醒コントロールマウスの脳領域にrCPSを提示する.また、翻訳の阻害剤であるアニソマイシンの生体内投与では、脳内のタンパク質合成を廃止することを実証する。
Protocol
Representative Results
Discussion
実験動物における生体内における脳タンパク質合成(rCPS)の局所的率の測定方法を提示する.この方法は、既存の方法に対してかなりの利点があります:1.測定は、目覚めの振る舞い動物で行われるので、それらは機能する脳の進行中のプロセスを反映します。2.測定は、同時に脳のすべての領域とサブ領域でrCPSを決定する能力を与える定量的な自動無線撮影によって行われます。3. この方法の運…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、マウスのジェノタイピングについてZengyan Xia、アミノ酸とフィルムの処理のためのトム・バーリン、rCPS実験の一部を行うためのメイ・チンを認めたい。本研究は、NIMH(ZIA MH00889)の内部研究プログラムの支援を受けました。RMSはまた、自閉症スピークポストドクターフェローシップ8679とFRAXAポストドクターフェローシップによってサポートされました。
Materials
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
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