Copolímeros de bloque sin capacidad de ejecución funcionalización de metionina para la entrega de ADN de plásmido dirigido
Summary
Este trabajo presenta la preparación de copolímeros de bloque biocompatibles funcionalizados de metionina (mBG) a través del método reversible de transferencia de cadena de adición-fragmentación (RAFT). También se investigó la capacidad de complejidad del ADN plásmido del mBG obtenido y su eficiencia de transfección. El método RAFT es muy beneficioso para la polimerización de monómeros que contienen grupos funcionales especiales.
Abstract
La polimerización reversible de la transferencia de cadena de fragmentación de adición (RAFT) integra las ventajas de la polimerización radical y la polimerización viva. Este trabajo presenta la preparación de copolímeros de bloque biocompatible funcionalizados de metionina a través de la polimerización RAFT. En primer lugar, N,N–bis(2-hidroxietilo)metacrilamida-b–N-(3-aminopropyl)metacrilamida (BNHEMA-b-APMA, BA) se sintetizó a través de la polimerización RAFT utilizando 4,4′-azobis(4-ácido cianovalórico) (ACVA) como un agente iniciador y ditiobenzoato de ácido 4-cianopentanoico (CTP) como agente de transferencia de cadena. Posteriormente, N,N-bis(2-hidroxietilo)methacrilamida-b–N-(3-guanidinopropyl)metacrilamida (metionina injertada BNHEMA-b-GPMA, mBG) se preparó modificando grupos de aminas en APMA con metionina y guanidina Grupos. Se sintetizaron tres tipos de polímeros de bloque, mBG1, mBG2 y mBG3, para la comparación. Se utilizó una reacción de ninhydrin para cuantificar el contenido de APMA; mBG1, mBG2 y mBG3 tenían 21%, 37% y 52% de APMA, respectivamente. Los resultados de la cromatografía por permeación en gel (GPC) mostraron que los copolímeros BA poseen pesos moleculares de 16.200 (BA1), 20.900 (BA2) y 27.200(BA3) g/mol. También se investigó la capacidad de complejo del ADN plásmido (ADNp) de los portadores del gen del copolímero de bloque obtenido. Las relaciones de carga (N/P) eran 8, 16 y 4 cuando pDNA se complejoba completamente con mBG1, mBG2, mBG3, respectivamente. Cuando la relación N/P de los polipleplexs mBG/pDNA fue superior a 1, el potencial Zeta de mBG fue positivo. En una relación N/P entre 16 y 32, el tamaño medio de partícula de los poliplexos mBG/pDNA estaba entre 100-200 nm. En general, este trabajo ilustra un protocolo simple y conveniente para la síntesis portadora de copolímero de bloque.
Introduction
En los últimos años, la terapia génica ha surgido para la entrega terapéutica de ácidos nucleicos como fármacos para tratar todo tipo de enfermedades1. El desarrollo de fármacos genéticos, como el ADN plásmido (PDNA) y el pequeño ARN interferente (SIRNA), se basa en la estabilidad y eficiencia del sistema de administración de fármacos (DDS)2. Entre todos los DDS, los portadores de polímeros catiónicos tienen las ventajas de una buena estabilidad, baja inmunogenicidad, y fácil preparación y modificación, que dan a los portadores de polímeros catiónicos amplias perspectivas de aplicación3,4. Para aplicaciones prácticas en biomedicina, los investigadores deben encontrar un portador de polímero catiónico con alta eficiencia, baja toxicidad y buena capacidad de focalización5. Entre todos los portadores de polímeros, los copolímeros de bloque sin hogar son uno de los sistemas de administración de medicamentos más utilizados. Los copolímeros de bloque se estudian intensamente por sus propiedades de autoensamblaje y sus capacidadespara formar micelas, microesferas y nanopartículas en la administración de fármacos 5. Los copolímeros de bloque se pueden sintetizar a través de métodos de polimerización viva o de química de clics.
En 1956, Szwarc y otros plantearon el tema de la polimerización viva, definiéndolo como una reacción sin reacciones de ruptura en cadena6,7. Desde entonces, se habían desarrollado múltiples técnicas para sintetizar polímeros utilizando este método; por lo tanto, la polimerización viva es vista como un hito de la ciencia de polímeros8. La polimerización viva se puede clasificar en polimerización aniónica viva, polimerización catiónica viva y polimerización radical de desactivación reversible (RDRP)9. Las polimerizaciones aniónicas/catiónicas vivas tienen un alcance limitado de aplicación debido a sus estrictas condiciones de reacción10. La polimerización radical controlada/viva (CRP) tiene condiciones de reacción leves, disposición conveniente y buen rendimiento y, por lo tanto, ha sido un foco de investigación importante en los últimos años11. En la PCC, las cadenas de propagación activas se pasivan reversiblemente en las inactivas para reducir la concentración de radicales libres y evitar la reacción bimolecular de propagar los radicales de la cadena. La polimerización adicional sólo puede continuar si las cadenas de propagación latentes inactivas se animan reversiblemente en radicales de cadena. Como una de las formas más prometedoras de polimerización radical viva, la polimerización reversible de la transferencia de cadena de fragmentación de adición (RAFT) es un método aplicable para producir polímeros de bloque sin peso y estructura molecular controlados, peso molecular estrecho distribución y transporte de grupos funcionales12. La clave para el éxito de la polimerización RAFT es el efecto de los agentes de transferencia de cadena, generalmente ditioestras, que poseen una constante de transferencia de cadena muy alta.
En este artículo, se diseñó un método de polimerización RAFT para preparar el polímero de bloque BNHEMA-b-APMA, tomando 4,4′-azobis(4-ácido cianoovalico) (ACVA) como agente iniciador y 4-cianopentanoico ácido dithiobenzoato (CTP) como agente de transferencia de cadena. La polimerización RAFT se utilizó dos veces para introducir BNHEMA en los portadores de polímeros catiónicos. Posteriormente, los grupos de aminas en la cadena APMA fueron modificados con metionina y el reactivo de guanidinilación 1-amidinopyrazol clorhidrato. Haciendo uso de las cargas positivas del reactivo de guanidinilación y la estructura del esqueleto del polímero de metacrilamida, se mejoró la eficiencia de admisión celular de los portadores de polímeros de bloque obtenidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio introdujo una serie de portadores de genes catiónicos de polímero de bloque BNHEMA-b-APMA. Estos polímeros de bloque se sintetizaron a través del método reversible de transferencia de cadena de adición-fragmentación (RAFT). El segmento hidrófilo BNHEMA se introdujo para mejorar la solubilidad. Se modificaron los grupos de metionina y guanidina paramejorar la capacidad objetivo y la eficiencia de transfección 5. El contenido de la cadena APMA aumentó y la guanidinilación en …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China (No. 2016YFC0905900), National Natural Science Foundation of China (Nos. 81801827, 81872365), Basic Research Program of Jiangsu Province (Fundación de Ciencias Naturales, No. BK20181086), y el Fondo de Investigación Científica del Hospital del Cáncer de Jiangsu (No. ZK201605).
Materials
| 1-hydroxybenzotriazole | Macklin Biochemical Co., Ltd,China | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-dioxane | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10008918 | AR |
| 1-amidinopyrazole Hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | A107935 | 98% |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | E106172 | AR |
| 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) | Aladdin Co., Ltd., China | A106307 | Analytical reagent (AR) |
| 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid | Aladdin Co., Ltd., China | C132316 | >97%(HPLC) |
| Acetate | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 81014818 | AR |
| Acetone | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10000418 | AR |
| Agarose | Aladdin Co., Ltd., China | A118881 | High resolution |
| Ascorbic acid | Aladdin Co., Ltd., China | A103533 | AR |
| DMSO | Aladdin Co., Ltd., China | D103272 | AR |
| Ethylene glycol | Aladdin Co., Ltd., China | E103319 | AR |
| N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide | ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| Ninhydrin | Aladdin Co., Ltd., China | N105629 | AR |
| PBS buffer | Aladdin Co., Ltd., China | P196986 | pH 7.4 |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | Pdna | pDNA |
| Sodium carbonate decahydrate | Aladdin Co., Ltd., China | S112589 | AR |
| Trimethylamine | Aladdin Co., Ltd., China | T103285 | AR |
References
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