Methionin funktionalisierte biokompatible Blockcopolymere für gezielte Plasmid-DNA-Lieferung
Summary
Diese Arbeit stellt die Herstellung von Methionin funktionalisierten biokompatiblen Blockcopolymeren (mBG) über das reversible Additions-Fragmentierungs-Kettentransfer-Verfahren (RAFT) vor. Die Plasmid-DNA-Komplexierungsfähigkeit des erhaltenen mBG und ihre Transfektionseffizienz wurden ebenfalls untersucht. Die RAFT-Methode ist sehr vorteilhaft für die Polymerisation von Monomeren, die spezielle funktionelle Gruppen enthalten.
Abstract
Die reversible Additions-Fragmentierungs-Kettenübertragung (RAFT)-Polymerisation integriert die Vorteile der Radikalpolymerisation und der lebenden Polymerisation. Diese Arbeit stellt die Herstellung von Methionin funktionalisierten biokompatiblen Blockcopolymeren über RAFT-Polymerisation vor. Erstens wurde N,N–Bis(2-Hydroxyethyl)methacrylamid-b–N-(3-aminopropyl)methacrylamid (BNHEMA-b-APMA, BA) mittels RAFT-Polymerisation mit 4,4′-Azobis(4-Cyanovalersäure) (ACVA) als Initiierungsmittel und 4-Cyanopentanosäure Dithiobenzoat (CTP) als Kettentransfermittel. Anschließend wurde N,N-bis(2-Hydroxyethyl)Methacrylamid-b-(3-guanidinopropyl)methacrylamid (Methionin transplantiert BNHEMA-b-GPMA, mBG) durch Modifizieren von Amingruppen in APMA mit Methionin und Guanidin hergestellt. Gruppen. Drei Arten von Blockpolymeren, mBG1, mBG2 und mBG3, wurden zum Vergleich synthetisiert. Eine Ninhydrin-Reaktion wurde verwendet, um den APMA-Gehalt zu quantifizieren; mBG1, mBG2 und mBG3 hatten 21 %, 37 % bzw. 52 % aPMA. Die Ergebnisse der Gelpermeationschromatographie (GPC) zeigten, dass BA-Copolymere Molekulargewichte von 16.200 (BA1), 20.900(BA2) und 27.200(BA3) g/mol besitzen. Die Plasmid-DNA-Komplexierungsfähigkeit der erhaltenen Blockcopolymer-Genträger wurde ebenfalls untersucht. Die Ladungsverhältnisse (N/P) waren 8, 16 und 4, wenn pDNA vollständig mit mBG1, mBG2, mBG3 komplexiert wurde. Wenn das N/P-Verhältnis von mBG/pDNA-Polyplexen höher als 1 war, war das Zeta-Potenzial von mBG positiv. Bei einem N/P-Verhältnis zwischen 16 und 32 lag die durchschnittliche Partikelgröße von mBG/pDNA-Polyplexen zwischen 100-200 nm. Insgesamt veranschaulicht diese Arbeit ein einfaches und bequemes Protokoll für die Blockcopolymer-Trägersynthese.
Introduction
In den letzten Jahren hat sich die Gentherapie für die therapeutische Abgabe von Nukleinsäuren als Medikamente zur Behandlung aller Arten vonKrankheiten1 herausgebildet. Die Entwicklung von Genmedikamenten einschließlich Plasmid-DNA (pDNA) und kleiner störender RNA (siRNA) beruht auf der Stabilität und Effizienz des Arzneimittelabgabesystems (DDS)2. Unter allen DDS haben kationische Polymerträger die Vorteile einer guten Stabilität, geringen Immunogenität und einfachen Vorbereitung und Modifikation, die kationischen Polymerträgern breite Anwendungsperspektiven geben3,4. Für praktische Anwendungen in der Biomedizin müssen Forscher einen kationischen Polymerträger mit hoher Effizienz, geringer Toxizität und guter Targeting-Fähigkeit finden5. Unter allen Polymerträgern sind Blockcopolymere eines der am häufigsten verwendeten Arzneimittelabgabesysteme. Blockcopolymere werden intensiv auf ihre Selbstmontageeigenschaften und Fähigkeiten zur Bildung von Mizellen, Mikrosphären und Nanopartikeln in der Wirkstoffabgabeuntersucht 5. Blockcopolymere können über lebende Polymerisation oder Klickchemiemethoden synthetisiert werden.
1956 sprachen Szwarc et al. das Thema der lebenden Polymerisation an und definierten es als Reaktion ohne kettenbrechende Reaktionen6,7. Seitdem wurden mehrere Techniken entwickelt, um Polymere mit dieser Methode zu synthetisieren; Daher wird die lebende Polymerisation als Meilenstein der Polymerwissenschaft8angesehen. Lebende Polymerisation kann in lebende anionische Polymerisation, lebende kationische Polymerisation und reversible Deaktivierung sradikalpolymerisation (RDRP)9klassifiziert werden. Lebende anionische/kationische Polymerisationen haben aufgrund ihrer strengen Reaktionsbedingungen einen begrenzten Anwendungsbereich10. Die kontrollierte/lebende Radikalpolymerisation (CRP) hat milde Reaktionsbedingungen, eine bequeme Disposition und eine gute Ausbeute und war damit in den letzten Jahren ein schwerpunktweise11. In CRP werden aktive Ausbreitungsketten reversibel zu ruhenden passiviert, um die Konzentration freier Radikale zu reduzieren und die bimolekulare Reaktion von sich ausbreitenden Kettenradikalen zu vermeiden. Die Additionspolymerisation kann nur fortgesetzt werden, wenn die inaktiven ruhenden Vermehrungsketten reversibel zu Kettenradikalen animiert werden. Als eine der vielversprechendsten Formen der lebenden Radikalpolymerisation ist die reversible Additions-Fragmentierungs-Kettentransfer-Polymerisation (RAFT) ein Verfahren, das zur Ausbeute von Blockpolymeren mit kontrolliertem Molekulargewicht und Struktur, schmalem Molekulargewicht Verteilung und das Tragen von Funktionsgruppen12. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen RAFT-Polymerisation ist die Wirkung von Kettentransfermitteln, meist Dithioeten, die eine sehr hohe Kettentransferkonstante besitzen.
In diesem Papier wurde ein RAFT-Polymerisationsverfahren entwickelt, um BNHEMA-b-APMA-Blockpolymer zu zubereiten, wobei 4,4′-Azobis(4-Cyanovalersäure) (ACVA) als Initiierungsmittel und 4-Cyanopentanosäure-Dithiobenzoat (CTP) als Kettentransfermittel verwendet werden. Die RAFT-Polymerisation wurde zweimal verwendet, um BNHEMA in die kationischen Polymerträger einzuführen. Anschließend wurden die Amingruppen in der APMA-Kette mit Methionin und dem Guanidaylierungsreagenz 1-Amidinopyzolhydrochlorid modifiziert. Durch die Verwendung der positiven Ladungen des Guanidalylierungsreagenzes und der Methacrylamid-Polymerskelettstruktur wurde die zelluläre Aufnahmeeffizienz der erhaltenen Blockpolymerträger verbessert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie führte eine Reihe von BNHEMA-b-APMA Block polymeren Genträgern ein. Diese Blockpolymere wurden über das reversible Additions-Fragmentierungs-Kettentransferverfahren (RAFT) synthetisiert. Das hydrophile Segment BNHEMA wurde eingeführt, um die Löslichkeit zu verbessern. Methionin- und Guanidingruppen wurden modifiziert, um die Zielfähigkeit und Transfektionseffizienz zu verbessern5. Der APMA-Kettengehalt erhöhte sich und die Guanidinylierung im mBG-Copolymer reduzierte die Partik…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde unterstützt durch das National Key Research and Development Program of China (Nr. 2016YFC0905900), National Natural Science Foundation of China (Nos. 81801827, 81872365), Basic Research Program of Jiangsu Province (Natural Science Foundation, No. BK20181086) und Jiangsu Cancer Hospital Scientific Research Fund (Nr. ZK201605).
Materials
| 1-hydroxybenzotriazole | Macklin Biochemical Co., Ltd,China | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-dioxane | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10008918 | AR |
| 1-amidinopyrazole Hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | A107935 | 98% |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | E106172 | AR |
| 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) | Aladdin Co., Ltd., China | A106307 | Analytical reagent (AR) |
| 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid | Aladdin Co., Ltd., China | C132316 | >97%(HPLC) |
| Acetate | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 81014818 | AR |
| Acetone | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10000418 | AR |
| Agarose | Aladdin Co., Ltd., China | A118881 | High resolution |
| Ascorbic acid | Aladdin Co., Ltd., China | A103533 | AR |
| DMSO | Aladdin Co., Ltd., China | D103272 | AR |
| Ethylene glycol | Aladdin Co., Ltd., China | E103319 | AR |
| N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide | ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| Ninhydrin | Aladdin Co., Ltd., China | N105629 | AR |
| PBS buffer | Aladdin Co., Ltd., China | P196986 | pH 7.4 |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | Pdna | pDNA |
| Sodium carbonate decahydrate | Aladdin Co., Ltd., China | S112589 | AR |
| Trimethylamine | Aladdin Co., Ltd., China | T103285 | AR |
References
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